2-APB通过STIM1调控Orai1通道机制研究

发布时间：2020-04-06 00:36

【摘要】：钙库操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)是一种内质网(endoplasmic reticulum,ER)钙离子浓度降低或耗竭诱导的外钙内流方式,介导SOCE的离子通道叫钙库操纵性钙通道(store-operated calcium channels,SOCs)。钙释放激活钙通道(calcium release-activated Ca~(2+)channel,CRAC)是最典型的一类SOCs,主要成分是基质相互作用分子蛋白(stromal interaction molecule,STIM)和钙释放激活钙通道蛋白(Orai)又称钙释放激活钙通道调节因子(calcium release-activated calcium channel molecule,CRACM)。Orai家族有3个同源蛋白:Orai1,Orai2和Orai3;STIM有2个亚型:STIM1和STIM2。经典的SOCE由STIM1和Orai1介导。位于内质网的STIM1是单跨膜蛋白:内质网腔N端作为感受器感受钙库钙离子浓度变化;内质网跨膜TM区将内质网腔钙离子浓度变化信号传递给胞浆游离的C末端;胞浆C末端发生构象变化形成寡聚体,并转位到内质网膜靠近细胞膜的位置形成斑块状(puncta)结构,结合并激活Orai1通道。Orai1是细胞膜上四跨膜的通道蛋白,是一种高选择性Ca~(2+)通道,其N末端和C末端都在细胞内。Orai1通常以二聚体形式存在,被STIM1激活后形成具有通道活性的六聚体,引发小幅度持续性钙内流,维持细胞钙稳态。这个内流的钙电流叫CRAC电流(calcium release-activated Ca~(2+)current,I_(CRAC))。CRAC通道功能与机体免疫功能密切相关,直接调控众多免疫细胞如T细胞、B细胞、肥大细胞等的生理功能,参与免疫应答。基因突变可造成CRAC通道功能缺陷,导致肌张力减退、自身免疫病、无汗症、外胚层发育不良和出血性疾病等,严重的甚至发生重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID),危及生命安全。虽然目前CRAC通道的分子构成已被揭示,然而其通道调控分子机制仍需深入研究。2-氨基乙氧基苯硼酸(2-Aminoethoxy-diphenyl borate,2-APB)是一种膜通透性化合物,早期被证实为三磷酸肌醇受体(Inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP_3R)抑制剂。后来研究发现2-APB可作为一种非特异性通道阻滞剂,有效抑制SOCE,目前已经成为研究CRAC通道的常用工具。2-APB对CRAC通道的影响非常复杂:低浓度(5μmol/L)的2-APB增强STIM1活化的I_(CRAC);高浓度(50μmol/L)的2-APB则表现短暂增强后快速抑制STIM1活化的I_(CRAC);高浓度(50μmol/L)的2-APB能直接门控Orai3和未结合STIM1的Orai1。2-APB激活CRAC通道的分子机制尚不明确。有人认为2-APB激活CRAC不需要STIM1,是直接作用于活化的Orai1,扩张Orai1通道孔直径,促进钙内流。然而本研究发现2-APB可以通过改变STIM1的CT末端(a.a.235-685,C-terminal,CT)分子构象暴露CAD结构域激活Orai1,产生钙内流。1.2-APB诱导STIM1 CT末端与Orai1相互作用为研究2-APB增强CRAC电流的分子机制,本实验在STIM1 CT末端(a.a.235-685,C-terminal,CT)连接双荧光标签蛋白(YFP-CT-CFP)后和Orai1-mKate共转染入Hela细胞中,2-APB处理后,激光扫描共聚焦显微镜观察发现原均匀分布于细胞质的YFP-CT-CFP转位至细胞膜,与Orai1-mKate共定位。说明2-APB可诱导YFP-CT-CFP和Orai1-mKate形成复合物。再将YFP-CT-CFP和Orai1-YFP共转染入Hela细胞,利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术监测两种蛋白分子之间的距离变化。在仅提供波长为405 nm的荧光标签蛋白CFP的激发光条件下,分别在CFP和YFP发射波长处收集信号,给予细胞2-APB刺激,激光扫描共聚焦显微镜显示,细胞质内原均匀分布的YFP-CT-CFP先后转位至细胞膜与Orai1-YFP共定位,并且二者分子间FRET迅速增加。表明携带CFP的STIM1 CT末端与携带YFP的Orai1之间分子距离10 nm,即二者间存在直接的相互作用。上述结果提示2-APB诱导STIM1 CT末端与Orai1相互作用。2.2-APB诱导STIM1 CT末端与Orai1相互作用并激活Orai1通道利用红色荧光的基因Ca~(2+)探针(genetically-encoded Ca~(2+)indicator,GECI)CMV-R-GECO1.2监测细胞内Ca~(2+)浓度变化。在Hela细胞中过表达YFP-CT-CFP,Orai1-CFP和CMV-R-GECO1.2后,加入不同浓度的2-APB,通过激光扫描共聚焦显微镜观察发现,低浓度的2-APB(5μmol/L)诱导了持续激活的Ca~(2+)内流,而高浓度2-APB(20μmol/L)则先激活强烈的Ca~(2+)内流后后快速阻断Ca~(2+)内流。3.2-APB诱导STIM1 CT末端CAD结构域发生构象转变为研究STIM1CT末端如何激活Orai1,首先将YFP-CT-CFP单转入Hela细胞中,给与2-APB刺激,共聚焦显微镜记录发现YFP-CT-CFP分子内FRET降低,提示STIM1 CT末端的折叠状结构转变为伸直型构象。随后于STIM1 CT末端的CRAC活化结构域(CRAC activation domain,CAD)上连接相同的双荧光标签蛋白(YFP-CAD-CFP),将构建好的质粒单转Hela细胞后,重复上述步骤,共聚焦观察发现YFP-CAD-CFP分子内FRET虽降低却并未形成斑块状聚集,也未转位至细胞膜。与Orai1-mKate共转时,YFP-CAD-CFP与过表达的Orai1在2-APB刺激后也不能发生共定位。由此揭示2-APB也能诱导STIM1 CT末端的CAD结构域发生构象转变。4.2-APB诱导STIM1 CT末端与Orai1相互作用依赖于Orai1的CBD和NBD结构域本实验将构建的缺失Orai1 C末端的STIM1结合位点(a.a.272-292,C-terminal CAD binding domain,CBD)和N末端的STIM1结合位点(a.a.73-85,N-terminal CAD binding domain,NBD)的表达载体Orai1-?CBD-mKate及Orai1-?NBD-mKate分别与YFP-CT-CFP共转Hela细胞,加入2-APB后,共聚焦记录荧光变化。结果显示过表达Orai1-?CBD-mKate的Hela细胞中的YFP-CT-CFP不能与Orai1-?CBD-mKate共定位于细胞膜,而缺失NBD表现与YFP-CT-CFP的共定位显著减少。据此表明2-APB诱导的Orai1和STIM1 CT末端之间的相互作用取决于Orai1的CBD片段,而NBD在此过程中起次要作用。结论:本研究证明2-APB通过促使STIM1 CT末端产生构象变化,暴露Orai1激活位点,诱导STIM1 CT末端与Orai1直接相互作用进而活化Orai1,引发细胞钙内流。Orai1的CBD片段和NBD片段均与2-APB诱导的STIM1 CT末端与Orai1结合相关。
【图文】：

15图 1. STIM1 CT 末端和 Orai1 分布示意图。A 示（左）50 μmol/L 2-APB 处理前后，共表达 Orai1-mKate 和 ST1-CT-YFP 的 HeLa 细胞内 Orai1-mKate 和 ST1-CT-YFP 分布变化图；比例尺为 10 μm。（右）荧光共定位量化分析图显示该分布的变化。绿色表示 ST1-CT-YFP，

17图 2. 2-APB 诱导 YFP-CT-CFP 和 Orai1-CFP 相互作用并产生巨大 Ca2+内流。YFP-CT-CFP，Orai1-CFP 和 CMV-R-GECO1.2 共转染 Hela 细胞。48 小时后，在共聚焦显微镜中观察活细胞。A示50 μmol/L 2-APB处理前后共聚焦下荧光分布改变；比例尺为20 μm。B 示 CMV-R-GECO1.2 记录下的不同浓度 2-APB 诱导的 Ca2+内流。C 示分别在 0 秒，，446
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R341

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本文编号：2615748