衣原体质粒编码蛋白pGP3结合LL-37对炎性反应影响

发布时间：2020-04-18 05:57

【摘要】：[目的]分别检测抗菌肽LL-37和衣原体质粒编码蛋白pGP3能否诱导人阴道上皮细胞MS74产生细胞因子IL-6和IL-8,检测pGP3与LL-37结合对MS74产生IL-6和IL-8过程的影响。分别检测pGP3和LL-37能否诱导脂多糖无应答的基因突变小鼠C3H/HeJ小鼠的骨髓来源中性粒细胞产生IL-6和IL-8,检测pGP3与LL-37结合对中性粒细胞产生IL-6和IL-8过程的影响。初步研究在体外衣原体质粒编码蛋白pGP3结合抗菌肽LL-37对炎症反应的影响。[方法](1)复苏人阴道上皮细胞MS74,使用DMEM培养基、10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素配制细胞生长液,体外培养细胞于24孔板,细胞密度1.5×10~5/ml。用pGP3和LL-37在37℃下于细胞培养基中共同孵育30分钟得到pGP3/LL-37复合物。设置正常细胞组、LL-37干预组(12μmol/L)、pGP3干预组(12μmol/L)、pGP3/LL-37复合物干预组(12μmol/L)。于37℃、5%CO_2干预24小时。收集上清液,使用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-6和IL-8。(2)从脂多糖无应答的TLR4基因突变小鼠C3H/HeJ小鼠的胫骨和股骨获得无菌的骨髓细胞。使用小鼠骨髓中性粒细胞分离液试剂盒分离出中性粒细胞,将红细胞溶解后,使用RPMI-1640培养基、10%胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素配制细胞生长液,细胞在37℃、5%CO_2下培养于10cm培养皿。每3天收集未贴壁的细胞培养于新的培养基。将中性粒细胞接种于24孔板,细胞密度1×10~6/ml,设置正常细胞组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预组(10ng/ml)、Pam3干预组(0.1μg/ml)、LL-37组干预(0.05μmol/L、0.25μmol/L、1.25μmol/L)、pGP3干预组(0.05μmol/L、0.25μmol/L、1.25μmol/L)、pGP3/LL-37复合物干预组(0.05μmol/L、0.25μmol/L、1.25μmol/L),于37℃、5%CO_2干预24小时。收集上清液,使用ELISA检测IL-6和IL-8。(3)统计学方法:实验所得数据使用SPSS22.0统计软件进行Wilcoxon秩和检验。[结果]pGP3不能诱导人阴道上皮细胞MS74分泌IL-6和IL-8,LL-37可诱导MS74分泌细胞因子IL-6和IL-8,LL-37与pGP3结合形成复合物后其促炎症活性被抑制(~(**)p0.01 wilcoxon秩和检验)。LL-37不能刺激中性粒细胞产生细胞因子IL-6和IL-8,pGP3可刺激中性粒细胞分泌低水平的细胞因子IL-6和IL-8,pGP3与LL-37结合形成复合物后其促炎症活性显著上升(~(**)p0.01 Wilcoxon秩和检验)。[结论]pGP3与LL-37结合形成稳定复合物会抑制LL-37的促炎症活性,但pGP3同样通过与LL-37形成复合物可提升其自身对骨髓来源中性粒细胞的促炎症活性。因此可以认为衣原体可能通过pGP3阻断宿主生殖道上皮组织对其不利的炎症反应来帮助自身存活和繁殖,同时,激活骨髓来源中性粒细胞介导的炎症反应来帮助其致病及播散,使炎症持续发展直至出现输卵管纤维化等后遗症。
【图文】：

冻存：用二甲基亚砜和胎牛血清按 1：9 的比例配置并选择状态良好的未用于实验的 MS74 细胞，弃掉细PBS 清洗。弃掉瓶中 PBS,加入 0.25%胰蛋白酶-EDT细胞松动后弃掉瓶中液体，时间不可过长以免损伤轻柔，加入提前预热过的细胞生长液 2ml，用移液枪单个细胞。转移细胞悬液至离心管，，1000rpm 离心 入 1ml 冻存液，用移液枪将细胞沉淀吹打混匀，使在 5×106/ml~1×107/ml，然后转移至冻存管中并标记慢冻速融原则，先将冻存管置于 4℃冰箱中 30 分钟时，然后放置于-80℃低温冰箱中过夜，最后转移至图 1 所示为密度 1.5×105/ml，倒置显微镜下观察可均匀，胞浆丰富。

2 pGP3 可抑制 LL-37 刺激 MS74 细胞分泌 IL-6 和C.t 导致的泌尿生殖系统感染的发生率增速迅猛，D[1]。C.t 可引发无症状感染，也引发尿道炎、宫颈种疾病，严重时可并发异位妊娠和输卵管炎导致的患者中 10%~20%可能发生输卵管性不孕[2]。C.t 感用的抗生素不敏感，导致感染反复、迁延，严重影了沉重的经济负担。因此防控沙眼衣原体感染是当衣原体共有一个高度保守的编码 8 个开放阅读框我复制和转录，名为 pORF1-8 或 pGP1-8[4]。其中体，于感染人类生殖道的晚期在细胞胞浆中大量累快速释放胞浆中的 pGP3 到细胞外环境中，从而 p了高度的免疫原性[10,13]。据 Tang L 等人的研究显示
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R374

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本文编号：2631788