寨卡病毒包膜蛋白糖环缺失的生物学效应研究

发布时间：2020-04-19 05:13

【摘要】：寨卡病毒与登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒等同为黄病毒科黄病毒属重要成员,是引起寨卡病毒病的病原体,主要流行于非洲、美洲、亚洲和太平洋地区。寨卡病毒是单股正链RNA病毒,其基因组长约11 kb,包括3个结构蛋白(C,prM/M和E)和7个非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中,包膜E蛋白主要负责行使受体结合及膜融合等重要功能,也是诱导产生保护性抗体的主要抗原。E蛋白主要由结构域Ⅰ(DomainⅠ,DⅠ),Ⅱ和Ⅲ组成。DⅠ连接DⅡ和DⅢ。DⅡ的融合环在膜融合期间与宿主相互作用,DⅢ含有特定的受体结合位点,在膜融合中有重要作用。与其他黄病毒相比,寨卡病毒E蛋白DⅠ的糖环含有从胞膜表面突出的单个糖基化位点,且包含一个较长的150环状区域。黄病毒的E蛋白的糖环区很不保守,即使在寨卡病毒的不同株中也存在不同,可能影响寨卡病毒等黄病毒的传播和致病性。寨卡病毒在进化过程中会获得一些适应性突变,导致感染力和传播能力显著增强,很可能是导致此次寨卡病毒世界大流行和数以千计的新生儿小头症的主要原因。我们通过序列分析发现,寨卡病毒非洲株在E蛋白糖环区存在不同氨基酸序列的缺失;同时,如果糖环缺失也是寨卡病毒的适应性突变,那么其对寨卡病毒生物学效应的影响及具体作用机制也是亟需阐明的科学问题。针对上述问题,我们首先应用生物信息学方法系统比较了E蛋白糖环缺失在全球寨卡病毒分离株中的分布情况,对其进化地位进行了分析;然后运用反向遗传学技术将该氨基酸序列缺失引入到寨卡病毒亚洲株的感染性克隆中,拯救获得了糖环缺失突变病毒;通过一系列体内外生物学功能鉴定,明确糖环缺失对寨卡病毒生物学功能的影响;最后通过分析糖环缺失突变体的结构明确其可能的作用机制。本研究主要包括两个部分:一、寨卡病毒糖环缺失突变体全长感染性克隆的构建与鉴定首先,为确认E蛋白糖环区域缺失的非洲株和亚洲株及相应的缺失序列,我们对寨卡病毒的基因组序列进行比对并建立了系统发生树。结果表明,寨卡病毒不同进化分支中均存在4至7个氨基酸的糖环缺失,尤其是新近分离的亚洲流行株中突然出现糖环缺失突变株,表明糖环缺失可能在寨卡病毒的进化中具有重要作用。然后,为了获得E蛋白糖环缺失的重组寨卡病毒并对其基本的生物学特征进行评价,我们运用反向遗传学技术将该氨基酸序列缺失引入到寨卡病毒FSS13025全长感染性克隆,构建并获得了E蛋白糖环缺失突变病毒。然后通过间接免疫荧光发现糖环缺失不影响寨卡病毒E蛋白的表达;增殖曲线分析显示糖环缺失没有改变寨卡病毒的复制能力;蚀斑实验确定了糖环缺失重组寨卡病毒的蚀斑形态没有发生变化;最后,通过糖基化实验发现糖环缺失导致寨卡病毒E蛋白不能进行糖基化修饰。我们的结果表明,糖环缺失在一定程度上影响了寨卡病毒的生物学特征。二、糖环缺失重组寨卡病毒的感染和致病能力评价为了明确糖环缺失重组寨卡病毒的感染和致病能力,我们采用不同的小鼠模型测定了突变病毒的神经毒力和神经侵袭力,利用蚊模型检测了突变病毒的感染力。结果发现,糖环缺失增强了寨卡病毒对乳鼠的神经毒力,并导致乳鼠出现更严重的小头症。而在A129和BALB/c成年小鼠模型上的致病性则明显降低。此外,糖环缺失还降低了寨卡病毒的经口感染能力,但对病毒通过蚊子中肠屏障的能力没有影响。最后,通过对重组寨卡病毒E蛋白的结构特征进行分析发现,糖环缺失引起寨卡病毒发生“乙型脑炎病毒样”构象变化,包括不寻常的“洞”和糖环的拓扑结构的显著变化,可能增强寨卡病毒与神经细胞上特定受体的结合。综上,本研究发现寨卡病毒E蛋白糖环特定氨基酸序列的缺失不仅在寨卡病毒非洲世系中存在,并且出现在当前流行的亚洲世系中,在寨卡病毒的适应性进化中可能有重要作用。此外,糖环缺失导致寨卡病毒在成年小鼠中的神经侵袭力和蚊虫中的感染力减弱;但增强其在乳鼠上的神经毒力及造成更严重的小头畸形,可能与糖环缺失导致寨卡病毒E蛋白结构发生“乙型脑炎病毒样”变化相关。我们的研究结果加深了对寨卡病毒致病机制的理解,同时,糖环缺失突变可作为寨卡病毒神经毒力监测的生物标志,因而有必要对糖环缺失的再现进行长期持续的监测。
【图文】：

环缺,病毒,突变体

2.2 方法2.2.1 系统发育分析从 Genbank 获取寨卡病毒全长基因组序列，，利用 MEGA7 对基因组进行核苷酸序列比对和系统发育分析。生物系统发生树采用最大似然法计算，核苷酸替代模型采用 GTR+G+I，循环次数执行 1000 次。2.2.2 克隆的构建为构建含有 E 蛋白糖环缺失的寨卡病毒突变体质粒，首先采用融合 PCR 的方法获得带有突变位点的 DNA 片段。然后利用 AvrII/NotI 双酶切体系将带有突变位点的 DNA 片段切下，与同样双酶切的寨卡病毒（FSS13025）全长感染性克隆质粒连接，从而获得含有糖环缺失的寨卡病毒突变体质粒。构建的突变质粒分别包括 E蛋白糖环内缺失 4 个和 6 个氨基酸序列。突变质粒的构建示意图如图 1-1 所示。融合 PCR 引物序列如表 1-2 所示。

序列,环缺,世系,非洲

图 1-2 寨卡病毒的亚洲和非洲世系中均存在糖环缺失 1-2 Glycan loop deletions are present in both Asian and African lineages of Z缺失寨卡病毒的系统发育分析 MEGA7 采用最大似然法建立生物系统发生树，核苷酸替代I，E 蛋白存在糖环缺失的非洲株和亚洲株分别用黄色和绿色突系统进化树上可以看出，寨卡病毒分为非洲和亚洲两个世系，其分为两个亚支，即亚洲本土株和美洲及太平洋流行株。从图中环缺失株主要分布在寨卡病毒非洲世系，在 1947 年，1963 年 1997 年共分离到 10 株含有糖环缺失的寨卡病毒株（其中一株组序列，其余 9 株含有寨卡病毒全长基因组序列），含有糖环缺分散在非洲世系的不同进化分支中，说明糖环缺失的独立出现月从韩国分离的两株寨卡病毒株在 E 蛋白糖环区域存在氨基酸
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373

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