Morin在骨癌痛大鼠模型中的作用与机制研究

发布时间：2020-05-05 18:00

【摘要】：背景和目的疼痛可以分为神经病理性疼痛和伤害性疼痛(炎性疼痛),其中炎性疼痛是由受损组织(手术、骨关节炎或创伤)的自然刺激或者化学介质引发;神经病理性疼痛是由感觉神经的直接损伤或者相关疾病(糖尿病或带状疱疹)引起的,而且这种疼痛主要是由产生神经内的动作电位的离子通道,即电生理的变化引发。一种特殊的疼痛类型-癌症诱发的疼痛可能涉及炎症和神经病理机制,一方面,肿瘤的扩张可以诱导组织损伤并释放各种炎症介质;另一方面,肿瘤也可以直接侵犯感觉神经,或者压迫目标组织的神经,这些都会引起神经性疼痛。因此,癌症诱发的疼痛可以被认为是一种混合性疼痛,但目前大量的证据表明它还有其他独特的特征,表明它应该被视为一个单独的疼痛疾病。在众多癌症诱发的疼痛中,由骨转移引起的骨癌痛(Bone cancer pain,BCP),是一种极其严重的疼痛类型。BCP通常属于中度和重度的疼痛类型,大约75%的晚期骨癌症患者都会经历骨癌痛,严重影响了患者的生存质量。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)主张镇痛药物依然是临床用于治疗和缓解BCP的主要药物,例如阿片类药物(吗啡、羟考酮和氢吗啡酮)。阿片类药物作用于脊髓,可通过减弱外周感受器的敏感性、减少疼痛的输入以及抑制脊髓神经元的活动来达到镇痛效果。此外,双磷酸盐、放疗、化疗药物在骨癌痛治疗中也发挥作用。目前,骨癌痛的常规治疗通常需要多种治疗手段的联合使用,例如放射治疗适用于疼痛部位或者发生骨转移的部位,与此同时用阿片类或其他药物进行全身治疗。在一些特别案例中,使用放射性同位素和侵入性技术可能有助于转移性骨癌疼痛的治疗。但是,BCP仍然得不到充分的控制,药物治疗效果并不理想。其原因主要是阿片类药物相关的不良反应,包括便秘、镇静、瘙痒以及恶心和呕吐等。其他的原因可能是患者对药物成瘾的恐惧,镇痛药物剂量不足以及辅助镇痛药的效果不足。而且化疗或者放疗本身对患者的一般状况要求较高,以及治疗过程中也会引发一系列的不良反应。长期以来,神经元一直被认为在BCP的发展和维持中发挥着至关重要的作用,新的研究证据表明,胶质细胞激活也在其中发挥类似作用。神经胶质细胞约占脑和脊髓整个体积的一半,包括星形胶质细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞。星形胶质细胞作为中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中最丰富的神经胶质细胞,能够在突触传递调节神经元的外部环境时,清除多余的离子并回收分泌的神经递质。小胶质细胞是中枢神经系统内的常驻巨噬细胞,通过吞噬感染或者损伤的细胞保护神经元。在生理条件下,星形胶质细胞和小胶质细胞都是静息状态的。但是,当损伤发生时,它们可以被激活。在啮齿动物的BCP模型中,星形胶质细胞和小胶质细胞的数量会在同侧脊髓背角中显著增加。此外,抑制胶质细胞活化或者减少胶质细胞释放的促炎性细胞因子,能够缓解BCP相关的机械性异常性疼痛、热痛觉过敏以及自发性疼痛。而且,在幼龄啮齿动物鞘内注射活化的小胶质细胞能够增加机械疼痛。这些研究表明胶质细胞在骨癌痛中发挥着重要作用。多种与骨癌痛发生发展相关的细胞因子都是在胶质细胞激活之后被分泌出来的。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种促炎症细胞因子,主要由活化的巨噬细胞和某些肿瘤细胞分泌产生。据报道,TNF-α可能通过不同的信号转导途径促进血管生成,诱导肿瘤生长和促进肿瘤转移。此外,在幼龄和纤维肉瘤小鼠中足底注射TNF-α后,均可诱导机械超敏反应,表明TNF-α可能能够引起外周致敏。而且大量的证据表明,脊髓胶质细胞来源的促炎症细胞因子在BCP模型中显著升高,如白细胞介素1β(IL-1β),白细胞介素6(IL-6)和TNF-α,它们参与慢性疼痛的发病机制并介导疼痛行为。通过增强脊髓兴奋性突触传递并促进疼痛状态,TNF-α和IL-1β可以直接诱导中枢致敏。通过缩爪阈值(Paw withdrawal threshold,PWT)和动态疼痛评分进行评估也验证了抑制这些促炎症细胞因子可以抑制胶质细胞的活性,从而减弱骨癌诱发的机械异常性疼痛和自发性疼痛。3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(Morin)是一种在多种草药和水果中发现的天然生物类黄酮,最初是从桑科家族成员中分离出来的,可以从叶子、果实、茎和许多植物枝干中提取。Morin已经被用作食品和草药,没有明确毒副作用报道。既往研究表明,Morin可能对包括糖尿病及慢性炎症等多种疾病都具有有益作用。机制研究表明,Morin通过调节许多酶的活性来发挥抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗肿瘤、抗高血压、抗菌和神经保护作用。例如,Morin通过抗氧化作用保护肌细胞、内皮细胞、肝细胞和红细胞;通过抑制神经炎症防止神经变性;并诱导细胞凋亡以防止癌变。在某些情况下,Morin显示出全身保护作用,能够减少多种药物的副作用,而不会干扰其正常功能。另外,体外和体内研究表明,Morin的人体毒性作用极低,并且长期使用具有良好的耐受性。这些研究表明,Morin可以单独使用或与其他药物联合使用,用以预防或者治疗许多人类疾病。Morin对于治疗慢性疾病具有良好的作用,它能够发挥抗炎、抗肿瘤和神经保护作用。鉴于Morin以上作用,我们推测Morin可能在骨癌痛的病理生理过程中起到调节作用,然而目前尚无Morin在骨癌疼痛模型中作用的研究,本研究旨在探讨Morin在骨癌疼痛模型中的镇痛潜能并揭示其作用机制。材料和方法本研究采用Walker 256大鼠乳腺癌细胞构建大鼠骨癌疼痛模型。将5 μl的Walker 256大鼠乳腺癌细胞(1×105个细胞/μl)注射入Sprague Dawley大鼠左侧胫骨腔。对照组大鼠则给予5 μl生理盐水处理。为了防止细胞发生漏溢,注射完成后原位保持注射针2分钟,并用骨蜡密封注射部位,分别缝合肌肉和皮肤层。手术后对实验大鼠进行连续七天的Morin处理(5 mg/kg,10 mg/kg,20 mg/kg),每天一次。并且利用Von Frey纤维丝测量仪测量后爪对Von Frey纤维丝刺激的触觉异常性疼痛的敏感性。通过缩爪机械阈值(PWT)和自由行走疼痛的评分来表征疼痛行为。通过实时荧光定量RT-PCR(Real time RT-PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blot,WB)的方法检测脊髓星形胶质细胞活化的标志物GFAP等分子的mRNA和蛋白表达水平,并进行灰度定量分析。所有数据均以平均值±标准差表示。单边或者双边ANOVA分析之后,进行Tukey检验。p值小于0.05被认为具有显著差异。所有的分析均采用SPSS软件(SPSS)进行。结果我们发现,与假手术组的缩爪机械阈值在手术后第4天之后越来越高不同,骨癌痛模型组产生并持续机械性异常性疼痛,其缩爪机械阈值在手术后的第7、10、13和16天呈现不断下降的趋势。而且,骨癌痛模型组的大鼠也产生了运动相关的疼痛行为,在手术后的第7、10、13和16天自由行走行为的评分不断升高。Morin处理过的模型组大鼠,自手术后第7天开始,其缩爪机械阈值的水平显著高于未处理的模型组大鼠,而自由行走行为的评分也显著低于未经处理的模型组大鼠。并且这种疼痛相关行为的缓解具有剂量依赖性,随着Morin剂量(5 mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)的增加而增加,当Morin的剂量为20mg/kg时,效果最明显。因为星形胶质细胞的活化在骨癌疼痛模型中发挥了重要作用,所以我们在已.经建立的骨癌疼痛大鼠模型中检测星形胶质细胞活化的情况。实时荧光定量RT-PCR和Western blot的结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠脊髓星形胶质细胞活化的标志物胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的mRNA和蛋白水平显著上调。而当用Morin(20 mg/kg)处理时,GFAP的mRNA和蛋白表达水平较未处理模型组均显著下调。所以,我们推测,Morin能够抑制骨癌痛大鼠模型脊髓星形胶质细胞的活化。促炎细胞因子的上调通常与胶质细胞活化相关,并且广泛参与骨癌疼痛的发生发展。对促炎细胞因子和抑炎细胞因子的检测结果可以发现,在肿瘤细胞植入后的第7天模型组大鼠脊髓中,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6以及抗炎细胞因子IL-10的mRNA和蛋白水平显著增加。而用Morin(20mg/kg)处理后,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平都显著下调,而抑炎细胞因子IL-10的mRNA和蛋白水平都显著上调。这些结果表明,Morin在骨癌痛大鼠模型的脊髓中能够差异地调节炎症状态。为了进一步阐明Morin在骨癌疼痛大鼠模型中发挥镇痛作用的机制,我们在Morin注射之前先分别鞘内注射AM630(一种选择性的大麻CB2受体拮抗剂),或者通过腹腔注射纳洛酮(一种阿片受体拮抗剂)。结果显示,纳洛酮(1 mg/kg)预处理没有明显影响,而AM630预处理明显减弱Morin的镇痛作用。AM630预处理组手术后的第7天的缩爪机械阈值与Morin处理组相比显著下降,与模型组相比并没有显著差异。而在手术后第16天,AM630预处理组的缩爪机械阈值与Morin处理组相比,并没有差异。纳洛酮预处理的缩爪机械阈值从手术后第7天到第16天一直显著高于肿瘤组,与Morin处理组没有显著差异。运动疼痛的评分的结果与缩爪机械阈值的结果一致。而且,我们发现,鞘内注射不同剂量的纳洛酮(10mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)均不能阻断Morin的镇痛作用。另外,与假手术组相比,模型组的CB2的蛋白表达水平显著下降。而在Morin(20mg/kg)处理之后,CB2蛋白表达水平显著上调。以上结果表明,CB2受体的激活可能介导了 Morin在骨癌疼痛大鼠模型中发挥的镇痛作用。结论骨癌痛大鼠模型能够产生并维持机械性异常性疼痛和运动相关的疼痛行为。Morin处理之后能够缓解骨癌痛大鼠模型的疼痛相关的行为,并且这种疼痛相关行为的缓解具有剂量依赖性,当Morin的剂量为20 mg/kg时,镇痛效果最佳。此外,Morin(20 mg/kg)处理之后能够显著降低骨癌痛大鼠模型脊髓中GFAP的表达,表明Morin能够抑制星形胶质细胞的活化。并且Morin能够抑制由癌症引起的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达上调,并上调抑炎细胞因子IL-10的表达。另外,用AM630预处理能够减弱Morin的抗伤害感受作用,并提高CB2受体的蛋白表达水平,而纳洛酮(1 mg/kg)预处理没有类似效果,表明CB2受体可能介导了 Morin在骨癌疼痛大鼠模型中发挥的镇痛作用。综上所述,天然植物来源的Morin能够抑制星形胶质细胞的活化以及神经炎症的发生从而发挥镇痛作用,并且这一作用依赖于CB2受体的活化。因此,Morin有望成为骨癌疼痛治疗更为安全、有效的新型药物。
【图文】：

骨癌,大鼠

剂量的Ｍｏｒｉｎ邋（５邋ｍｇ／ｋｇ、１０邋ｍｇ／ｋｇ和２０邋ｍｇ／ｋｇ）或生理盐水。假手术组和骨癌逡逑痛模型组的大鼠在手术后第３天都显示机械性异常疼痛的缩爪阈值较低，并且自逡逑由行走行为的分数在手术后第３天显著高于手术前的分数（图１和图２）。而且逡逑生理盐水治疗并未改变骨癌痛模型组和假手术组大鼠的机械异常性疼痛或者自逡逑由行走疼痛（数据未显示）。逡逑与之前的报道一致＠６５］，骨癌痛模型组大鼠产生并维持机械性异常性疼痛，逡逑它的缩爪机械阈值在手术后的第７、１０、１３和１６天呈现不断下降的趋势（图１）。逡逑但是在手术后第４天，骨癌痛模型组与假手术组的缩爪阈值没有差异，而在术后逡逑第７、１０、１３及１６天，模型组与假手术组的缩爪阈值产生显著差异，假手术组逡逑的缩爪机械阈值在第４天以后越来越高，而骨癌痛模型组大鼠的缩爪机械阈值则逡逑越来越低。值得注意的是，如图１所示，与未处理的骨癌痛模型组大鼠相比，逡逑Ｍｏｒｉｎ以剂量依赖性方式降低了骨癌痛模型组大鼠中的机械异常性疼痛。我们可逡逑以看到从术后的第７天开始，给予Ｍｏｒｉｎ处理，缩爪阈值的水平显著高于未处理逡逑的骨癌痛模型组大鼠。并且这种缩爪阈值的升高随着Ｍｏｒｉｎ剂量的升高而升高，逡逑当Ｍｏｒｉｎ的浓度为５邋ｍｇ／ｋｇ时

骨癌,大鼠,剂量,超敏反应

骨癌痛模型组大鼠也产生了运动相关的疼痛行为。与假手术组的自由逡逑行走评分在手术后第４天之后越来越低不同，骨癌痛模型组大鼠在手术后的第７、逡逑１０、１３、１６天自由行走行为与前期相比明显增氋（图２）。另外，我们还发现逡逑Ｍｏｒｉｎ以剂量依赖性的方式减弱了骨癌痛模型组大鼠的自由运动疼痛（图２）。逡逑当Ｍｏｒｉｎ剂量为５邋ｍｇ／ｋｇ时，，与未经处理的骨癌痛模型组相比，Ｍｏｒｉｎ对运动疼逡逑痛的评分并没有影响。而当Ｍｏｒｉｎ的剂量为２０邋ｍｇ／ｋｇ时，运动疼痛的评分显著逡逑降低，并且在手术后第１３天最明显。综上所述，这些数据表明，用Ｍｏｒｉｎ慢性逡逑治疗可以减轻癌症相关的超敏反应行为，并且Ｍｏｒｉｎ达到最佳镇痛效果的浓度为逡逑２０邋ｍｇ／ｋｇ邋0逡逑ｃ邋４－逡逑｜３＇逡逑Ｊ５逦＾邋夺一一ｗ逦■逦＇逡逑二邋１．逦－逦，，逦？＊，－逦，＇兵逦？＇料逡逑Ｓ邋Ａ逦——－逦－逦
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738;R-332

【相似文献】