肠出血性大肠埃希菌O157:H7噬菌体分离鉴定及初步应用研究
发布时间：2020-05-09 20:32
【摘要】：大肠埃希菌O157:H7是一种重要的食源性致病菌,可引起严重的腹泻,出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症。大肠埃希菌O157的污染已成为影响全球食品公共安全的重要因素。世界各地每年都会有因食用大肠埃希菌O157污染的蔬菜肉类而导致腹泻甚至死亡的疫情爆发,然而传统食品灭菌剂已不能满足日趋严重食品安全问题。噬菌体因其特异的灭菌方式渐渐受到人们的关注。本研究以大肠埃希菌O157为宿主菌,从医院污水中筛选出两株裂解性噬菌体,分别命名为FEC14,FEC19。生物学特性研究结果表明:两株噬菌体均是裂解性强,宿主谱宽,稳定性高的肌尾病毒科噬菌体,但它们却有明显的不同。透射电子显微镜显示噬菌体FEC19有一个直径约58nm±3nm的正20面体头部和可收缩的尾部,尾丝为针状,而噬菌体FEC14的头部直径约80nm±5nm,尾丝呈现星状。噬菌体FEC14比噬菌体FEC19的裂解谱更宽:噬菌体FEC14能够裂解全部14株大肠埃希菌O157,噬菌体FEC19却只能裂解11株大肠埃希菌O157。噬菌体FEC14和FEC19的最佳感染复数分别为0.001和0.1,潜伏期分别为15min和10min,生长期分别为65min和80min。噬菌体FEC14比FEC19对温度更加敏感。70℃时噬菌体FEC14逐渐在40min内丧失全部活力,而噬菌体FEC19在80℃下20min时才完全失活。噬菌体FEC14在酸碱环境下比噬菌体FEC19的稳定性要高。噬菌体FEC14在pH 3-12条件下仍有活性,而噬菌体FEC19只能在pH 4-11的条件下存活。噬菌体FEC19的基因可被3种限制性核酸内切酶(EcoRⅤ,HindⅢ,XbaⅠ)切开,噬菌体FEC14不能被实验室常用的十种核酸内切酶切开。推测其原因为噬菌体FEC14的DNA被修饰导致基因组对限制性内切酶产生抗性。噬菌体FEC14和FEC19进行全基因组测序并分别上传至Genbank,序列号为MG383452和MH816966。由于噬菌体FEC14比噬菌体FEC19的基因信息含量大且丰富,因此只选取噬菌体FEC14的基因组进行深入分析。噬菌体FEC14的基因组全长158639bp,GC含量为44.6%,基因组含有210个ORF,4个tRNA,其中预测为已知功能的ORF有73个,目前尚未检测出毒力基因和耐药基因。进化分析显示它属于肌尾噬菌体科,Tevenvirinae亚科,Vilvirus属。总结出该属噬菌体有着区别于其他肌尾噬菌体的显著特征包括:噬菌体的形态、基因组大小、基因同线形、使用非规范碱基等。对两株噬菌体在人工污染牛肉上杀菌效果进行评估,结果显示:在染菌牛肉上单独使用FEC14、FEC19噬菌体或鸡尾酒法都能有效的降低宿主菌数量,其中噬菌体FEC19的防控效果强于噬菌体FEC14,4℃的防控效果强于室温,单一施用噬菌体与鸡尾酒法防控效果相当,但考虑宿主菌耐受问题,最好选用鸡尾酒法进行宿主菌的防控。综上,本实验得到的两株裂解性噬菌体FEC14和FEC19在控制食品中大肠埃希菌O157污染的应用中具有很大潜力,将来可以开发为产品用于食品安全领域。
【图文】：
对其基因组进行测序和深入分析，从而扩大我们对噬菌体多样性和进化关系的认识。1.2.2 噬菌体作用机制噬菌体作用宿主菌的第一步就是吸附，宿主菌表面存在特定的受体(如脂多糖、磷壁酸、鞭毛等)是噬菌体感染细菌所必需的。这些受体的多样性决定着噬菌体感染宿主菌的特异性。同时，细菌的类型、生长环境、毒力等因素也会影响噬菌体吸附在宿主菌表面[31]。当噬菌体吸附到细菌表面受体后，噬菌体会释放裂解酶来溶解细菌细胞壁，，从而将其遗传物质注入细菌细胞质内。根据噬菌体的类型，噬菌体会以两种途径在宿主菌体内增殖(如图 1)：一种是裂解性噬菌体主导的裂解途径；另一种是温和噬菌体主导的溶原途径。
A18 Sheep + + + + - -A19 Human + + + + + +A20 Human + + + + + +C1 Chicken + + + + + +E1 Food + + + + + +注：“+”为阳性结果；“-”为阴性结果；“*”为未知。(2) 产志贺毒素基因 stx1 和 stx2 的鉴定志贺毒素基因（stx1 和 stx2）编码的志贺样毒素是细菌最主要的毒力因子，志贺毒素基因的存在大大增加了细菌的致病性。本实验将 14 株含有 O157：H7抗原的大肠埃希菌进行 PCR 检测产志贺毒素基因 stx1(614bp)和 stx2(779bp)。其中有 4 株存在产志贺毒素基因 stx1 和 stx2 缺失，其它 10 株均含有毒素基因，详细结果见图 2.1，图 2.2，表 2.3。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378.2
本文编号：2656698
【图文】：
对其基因组进行测序和深入分析，从而扩大我们对噬菌体多样性和进化关系的认识。1.2.2 噬菌体作用机制噬菌体作用宿主菌的第一步就是吸附，宿主菌表面存在特定的受体(如脂多糖、磷壁酸、鞭毛等)是噬菌体感染细菌所必需的。这些受体的多样性决定着噬菌体感染宿主菌的特异性。同时，细菌的类型、生长环境、毒力等因素也会影响噬菌体吸附在宿主菌表面[31]。当噬菌体吸附到细菌表面受体后，噬菌体会释放裂解酶来溶解细菌细胞壁，，从而将其遗传物质注入细菌细胞质内。根据噬菌体的类型，噬菌体会以两种途径在宿主菌体内增殖(如图 1)：一种是裂解性噬菌体主导的裂解途径；另一种是温和噬菌体主导的溶原途径。
A18 Sheep + + + + - -A19 Human + + + + + +A20 Human + + + + + +C1 Chicken + + + + + +E1 Food + + + + + +注：“+”为阳性结果；“-”为阴性结果；“*”为未知。(2) 产志贺毒素基因 stx1 和 stx2 的鉴定志贺毒素基因（stx1 和 stx2）编码的志贺样毒素是细菌最主要的毒力因子，志贺毒素基因的存在大大增加了细菌的致病性。本实验将 14 株含有 O157：H7抗原的大肠埃希菌进行 PCR 检测产志贺毒素基因 stx1(614bp)和 stx2(779bp)。其中有 4 株存在产志贺毒素基因 stx1 和 stx2 缺失，其它 10 株均含有毒素基因，详细结果见图 2.1，图 2.2，表 2.3。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378.2
本文编号：2656698
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