旋毛虫成虫特异性DNaseⅡ-1和DNaseⅡ-7的表达鉴定及其免疫保护作用

发布时间：2020-05-10 08:26

【摘要】：旋毛虫病是一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,是由于生食或食用了未熟的感染了旋毛虫的肉类而感染。人和动物感染旋毛虫在中国大多数省份均有报道,旋毛虫病不仅严重威胁公众健康,同时还影响养猪业的经济效益和肉类食品安全。因此,需要发展疫苗来阻断旋毛虫从家养动物向人类的传播。我们课题组前期应用Western blot和鸟枪法液相色谱质谱联用(shotgun LC-MS/MS)技术,使用旋毛虫感染小鼠及病人的早期血清从成虫的排泄分泌(ES)蛋白中筛选出了旋毛虫成虫特异性DNase II-1(TsDNase Ⅱ-1)/DNase II-7(TsDNase Ⅱ-7)。脱氧核糖核酸酶II(DNase II)是一种广泛存在的核内切酸酶,可以通过水解DNA的磷酸二酯键降解DNA而发挥其生化功能,并且在逃避宿主免疫防御和病原体入侵过程中发挥重要作用。DNA疫苗利用真核表达载体,所表达蛋白经过折叠和修饰,比原核表达的蛋白更近似于天然构象。利用减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体,通过口服的方式进行免疫可以更有效地诱导粘膜免疫应答,更有利于杀伤和排出寄生于宿主肠道的虫体。本研究克隆表达、纯化了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7,免疫小鼠获得了免疫血清,通过Real-time PCR、Western blot和间接免疫荧光试验(IIFT)鉴定了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫不同发育时期的转录、表达及定位;观察了抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫血清对旋毛虫体外侵入肠上皮细胞(IEC)单层的抑制作用及抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7特异性抗体介导的巨噬细胞对旋毛虫新生幼虫的杀伤作用;构建了减毒沙门氏菌为载体的TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7DNA疫苗,检测了rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7皮下接种免疫及口服DNA疫苗免疫小鼠的免疫应答类型和对小鼠的免疫保护效果,证实了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7可作为抗旋毛虫感染疫苗的候选靶标蛋白。材料与方法1.实验动物、旋毛虫虫种、菌株及细胞系本研究使用的实验动物为6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,购自河南省实验动物中心。旋毛虫虫种(T1,ISS534)是由本实验室小鼠每6个月传代保种。鼠伤寒沙门氏菌"縞yaSL1344株来自河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重点实验室。实验所用小鼠小肠上皮细胞IEC由本课题组前期分离获得;乳仓鼠肾细胞BHK-21来自河南省疾控中心细胞资源中心。2.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息学分析及表达与鉴定利用NCBI、ExPasy、BepiPred等在线软件对TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的结构域、理化性质及抗原位点进行生物信息学分析;从3d成虫cDNA中扩增TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因并构建原核表达质粒对rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7进行表达和纯化,通过Real-time PCR、Western blot和IIFT分析了TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫(IIL)、成虫和新生幼虫时期的转录、表达及定位。通过体外侵入IEC单层和ADCC实验观察TsDNase Ⅱ特异性抗体对旋毛虫侵入中的作用。3.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠诱导的免疫应答将纯化的重组蛋白rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7、rTsDNase Ⅱ-1+7混合蛋白、佐剂及PBS分别皮下注射免疫小鼠。初次免疫后0、10、20和30d尾静脉采血收集小鼠血清,运用间接ELISA方法检测并分析rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠后引起IgG、IgG1和IgG2a水平的变化。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重组沙门氏菌DNA疫苗的构建及鉴定构建真核重组质粒pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7,用脂质体法将其转入BHK-21细胞中,用RT-PCR和IIFT鉴定质粒在体外的转录和表达。将重组质粒用电转法转化进入减毒沙门氏菌后口服免疫小鼠,免疫后1周采集小鼠脾脏和肠系膜淋巴结,用RT-PCR和IIFT鉴定质粒在小鼠体内的转录和表达。5.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答收集DNA疫苗初次免疫后0、10、20和30d的小鼠血清、肠道冲洗液、脾细胞和肠系膜淋巴结细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a的水平和肠液中总IgA、特异性IgA水平。将脾细胞和肠系膜淋巴结细胞分别用rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7刺激72h,收集细胞培养上清,采用双抗体夹心ELISA法检测细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10)的水平。此外,应用IIFT检测免疫小鼠血清IgG和肠道冲洗液IgA对旋毛虫不同发育时期虫体的识别,进一步验证DNA疫苗所引起的免疫应答。6.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫对小鼠的免疫保护作用分别用皮下注射rTsDNase Ⅱ和口服DNA疫苗2种途径免疫小鼠,末次免疫后10d,每只小鼠经口感染300条旋毛虫肌幼虫。攻击感染后5d剖杀小鼠,收集肠道成虫并计算成虫减虫率;感染后42 d剖杀小鼠收集肌幼虫并计算肌幼虫减虫率,以观察免疫保护效果。7.统计学处理使用SPSS 17.0统计分析软件对实验数据进行分析统计。数值的表述方式为平均值±标准差。多个实验组之间的比较运用单因素方差分析,两组间比较使用t检验和卡方检验,检验显著性水平:α=0.05。结果1.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的生物信息学分析及表达与鉴定测序结果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7的完整cDNA序列分别为1221 bp和1161bp,预测的开放阅读框分别编码347和348个氨基酸,分子量大小分别为38.06 kDa和38.22 kDa,等电点分别为7.58和7.56。Western blot分析结果显示,IIL、成虫、新生幼虫粗提蛋白和成虫ES蛋白中的天然TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7可以被抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7的血清识别。Real-time PCR结果表明,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在旋毛虫各发育期虫体均有转录;IIFT结果显示,TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7在成虫和新生幼虫虫体表面均有表达,并且主要位于虫体组织切片的表皮和杆状体。经抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清孵育的IIL,体外对肠上皮细胞的侵入率分别为40.13%和32.65%,明显低于免疫前血清组(4.01%,χ_1~2=105.012,χ_2~2=70.118,P0.01);ADCC结果显示,抗rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7血清组的新生幼虫死亡率(66.84%和63.39%)明显高于免疫前血清组(15.30%,t_1=26.420,t_2=22.599,P0.01),对新生幼虫的这种细胞毒性具有抗体剂量依赖性(F_1=69.569,F_2=68.231,P0.01)。2.rTsDNase Ⅱ-1和rTsDNase Ⅱ-7免疫小鼠诱导的免疫应答rTsDNase Ⅱ-1、rTsDNase Ⅱ-7和2种蛋白混合免疫小鼠均可产生高滴度的血清特异性抗体,且rTsDNase Ⅱ-1(t_(20d)=13.318,t_(30d)=56.608,P0.01)、rTsDNase Ⅱ-7(t_(20d)=17,507,t_(30d)=22.466,P0.01)和2种蛋白混合(t_(20d)=7.821,t_(30d)=24.942,P0.01)免疫小鼠后20和30 d,血清IgG1水平均明显高于IgG2a水平,表明rTsDNase Ⅱ免疫小鼠后引起了以Th2型为主的Th1/Th2混合型免疫应答。3.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7重组沙门氏菌DNA疫苗的构建及鉴定双酶切和测序验证结果证明成功构建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗。体外转染BHK-21细胞后,RT-PCR和IIFT检测结果显示转染细胞中存在TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7基因转录和蛋白表达。对DNA疫苗免疫1周后的小鼠脾脏和肠系膜淋巴结进行RT-PCR和IIFT实验,结果表明经口免疫TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗,TsDNase Ⅱ在脾脏和肠系膜淋巴结中成功转录和表达。4.TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答小鼠经ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1和ΔcyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-7第2次和第3次免疫后,血清特异性IgG水平均有明显升高,且IgG1水平明显高于IgG2a水平(P0.01);肠道冲洗液中总IgA和特异性IgA也均有明显的升高。在初次免疫后10d、20d和30d,小鼠脾细胞和肠系膜淋巴结细胞经rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7刺激后,IFN-γ、IL-4和IL-10水平明显高于空质粒组和PBS组(P0.01),表明TsDNase Ⅱ-1和TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫小鼠后引起了Th1/Th2免疫应答,并诱导了粘膜免疫应答。5.rTsDNase Ⅱ及DNA疫苗免疫对小鼠的免疫保护作用rTsDNase Ⅱ-1免疫组的成虫减虫率(40.36%)明显高于rTsDNase Ⅱ-7免疫组(34.86%)(t=2.480,P0.05);2个免疫组的肌幼虫减虫率(50.43%vs 42.33%)的差异无统计学意义(t=1.008,P0.05)。TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗组的成虫减虫率(53.85%)亦明显高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗组(46.15%)(t=3.253,P0.05),2个免疫组的肌幼虫减虫率(59.26%vs53.41%)的差异也无统计学意义(t=1.685,P0.05)。结果表明,rTsDNase Ⅱ蛋白和DNA疫苗免疫接种均对小鼠产生了部分免疫保护效果。TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗免疫的小鼠,肠道成虫减虫率明显高于rTsDNase Ⅱ蛋白免疫组(t_1=2.670,t_2=2.812,P0.05);TsDNase Ⅱ-1或TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗口服免疫小鼠的肌幼虫减虫率与rTsDNase Ⅱ-1或rTsDNase Ⅱ-7蛋白免疫组相比差异无统计学意义(t_1=1.641,t_2=1.429,P0.05)。结论1.成功构建了pQE-80L-TsDNase Ⅱ-1/7重组表达质粒,并表达了rTsDNase Ⅱ-1/7蛋白;TsDNase Ⅱ-1/7在旋毛虫不同发育时期均有转录,在除肌幼虫外的各发育时期均有表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和胚胎。2.构建了△cyaSL1344/pcDNA3.1-TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗,2种DNA疫苗免疫小鼠均引起了以Th2型为主的Th1/Th2混合型免疫应答以及特异性的黏膜免疫应答。3.TsDNase Ⅱ-1/7 DNA疫苗口服或rTsDNase Ⅱ皮下注射免疫小鼠均可产生对旋毛虫感染的部分免疫保护作用,各免疫组间肌幼虫减虫率的差异无统计学意义,但TsDNase Ⅱ-1 DNA疫苗免疫小鼠后成虫的减虫率明显高于TsDNase Ⅱ-7 DNA疫苗组及rTsDNase Ⅱ蛋白免疫组。4.TsDNase Ⅱ为旋毛虫侵入相关蛋白并可作为旋毛虫疫苗的候选靶向分子。
【图文】：

序列,蛋白,氨基酸,亲水性

密码子（ATG）到 1044 位终止密码子（TAA），编码 347 个氨基酸，1045bp 到 1221bp为 3’UTR（非编码区）。预测其分子质量为 38.06kDa，，等电点为 7.58；不稳定指数 38.34，认为该蛋白稳定，脂肪指数是 82.45，总平均亲水性是 0.097，认为 TsDNaseII-1 蛋白为亲水性蛋白。使用 Protscale 程序 Hphob./Kyte and Doolittle 方法预测 TsDNase II-1 蛋白疏水性分析显示，该蛋白在 5’N 端有明显疏水性区域（图 1.1a）。TsDNaseII-1 蛋白无跨膜区，1-18 位氨基酸为信号肽序列，证明 TsDNaseII-1 为分泌性蛋白，其成熟的肽段始于第 19 位氨基酸（图 1.2 a）。TsDNase II-7（GenBank: AY963701.1），序列全长 1161 bp，其中从 4bp 起始密码子（ATG）到 1050bp 终止密码子（TAA），编码 348 个氨基酸，1051bp 到 1161bp 为 3’UTR。预测其分子质量为 38.22kDa，等电点为 7.56；不稳定指数 37.96，认为该蛋白稳定，脂肪指数是 85.83，总平均亲水性是 0.052，认为 TsDNase II-7 蛋白为亲水性蛋白。使用Protscale 程序 Hphob./Kyte and Doolittle 方法预测 TsDNase II-7 蛋白疏水性分析显示，该蛋白在 5’N 端有明显疏水性区域（图 1.1b）。TsDNaseII-7 蛋白无跨膜区，1-18 位氨基酸为信号肽序列，证明 TsDNase II-7 为分泌性蛋白，其成熟的肽段始于第 19 位氨基酸（图 1.2 b）。

蛋白信号,结构域

图 1.2 TsDNase II-1（a）及 TsDNase II-7（b）蛋白信号肽预测2.1.2 二级结构、三级结构及结构域预测使用在线软件 PSIPREDv3.3（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测蛋白二级结构。预测结果显示，TsDNase II-1 蛋白的二级结构包含有 7 个 α-螺旋、15 个 β-折叠、24 个无规则卷曲（图 1.3）。NCBI 结构域预测显示，TsDNase II-1 包含在第 19-155 位之间是一个 PLDc_DNaseII_1 结构域，第 22-340 位之间是一个完整的 DNaseII 结构域（图1.5）。TsDNase II-7 蛋白的二级结构包含有 8 个 α-螺旋、7 个 β-折叠、15 个无规则卷曲（图 1.4）。结构域预测显示，TsDNase II-7 包含在第 20-154 位之间是一个PLDc_DNaseII_1 结构域，第 22-341 位之间是一个完整的 DNaseII 结构域（图 1.5）。使用 SWISS-MODEL 同源模建软件对 TsDNase II-1（图 1.6 a）及 TsDNase II-7（图 1.6 b）蛋白的三级结构。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R383.15

【参考文献】