ASXL3复合杂合突变小鼠模型中生物信息分析的应用以及与SOCS3及PSD95基因的相互关系

发布时间：2020-05-10 12:52

【摘要】：目的1、探讨染色体微阵列技术和高通量测序技术在超声结构异常家系中的应用价值。2、探讨RNA-seq测序技术在ASXL3复合杂合突变小鼠模型中的应用价值。3、探讨ASXL3基因的可能作用机制以及与SOCS3和PSD95之间的相关关系。方法1、选取在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心就诊的一个连续生育三胎先天性心脏病的患儿家系,同时收集100例正常健康对照和122例先天性心脏病胎儿病例做扩展验证。2、按照标准操作流程提取胎儿(患儿)的基因组DNA,并使用分光光度计对DNA浓度和纯度进行测量,符合标准后进行细胞培养、常规G显带染色体核型分析。3、根据美国Affymetrix公司提供的CytoScan HD芯片平台的标准实验操作流程对样本DNA进行消化、连接、扩增、片段化、标记荧光信号、杂交、洗涤、染色以及芯片扫描。使用CHAS软件对扫描芯片产生的.CEL文件进行数据分析,并结合目前的数据库(DGV、OMIM、DECIPHER、ISCA等)对分析结果进行比对,判断CNVs的性质。4、应用全外显子高通量测序技术该家系5个样本进行检测,采用美国Illumina公司的Hiseq 2500高通量平台进行实验操作,按照操作手册对测序数据进行相应处理后,进行家系分析及致病基因的筛选,测序数据分析采用ClinVar、Exac、HGMD、Mutation Taster、SIFT和PloyPhen等数据库进行分析。5、用一代测序(Sanger测序)的方法对筛选突变和对照组进行验证分析。6、对筛选的突变基因做小鼠模型的构建。7、选取构建成功后的小鼠大脑、小脑及心脏组织,按照操作流程,进行RNA-seq测序分析。并结合GO分析、KEGG分析及共表达网络分析等对筛选的差异表达基因做关联分析。8、采用神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)对候选基因做功能验证,按照标准实验操作流程,体外培养SK-N-SH细胞,将慢病毒载体(Lv-control)和表达ASXL3的重组慢病毒(Lv-siASXL3)分别处理SK-N-SH细胞,作为对照组和实验组,通过CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪观察细胞凋亡、Western-blot和实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中SOCS3及PSD95的蛋白和m RNA的表达情况。结果1、在先天性心脏病家系中,胎儿染色体核型未检出异常,染色体微阵列分析(CMA)未检出明确致病性微缺失或微重复变异。2、家系做全外显子测序结果显示患者均存在ASXL3基因c.2168CG(p.P723R)和c.5449 CG(p.P1817A)复合杂合子,而在对父母的分析中发现,父亲为c.2168CG(p.P723R)杂合携带者,母亲为c.5449 CG(p.P1817A)杂合携带者。未检出已知的先天性心脏病相关基因突变。3、对222例患儿(胎儿)的扩展验证中也发现一例ASXL3基因c.3256CT(p.R1176W)和c.4643AG(p.D1548G)复合杂合突变,其中患儿父亲为c.3256CT(p.R1176W)杂合携带者,母亲为c.4643AG(p.D1548G)携带者。4、通过RNA-seq测序我们发现复合杂合突变小鼠中ASXL3的表达要明显低于野生对照组,同时检出了56,917 lncRNAs和16,567 mRNAs,根据共表达网络分析,我们发现了3个lncRNAs(NONMMUT041409.2,NONMMUT047824.2,and NONMMUT135643.1)以及相关联的3个mRNAs(Fos,SOCS3 and Slc6a4)。5、在体外细胞实验中,CCK-8实验结果表明,ASXL3干扰后实验组(Lv-siASXL3)细胞增殖能力较对照组(Lv-control)无明显增强。流式细胞仪结果也提示ASXL3干扰后实验组(Lv-siASXL3)细胞凋亡较对照组(Lv-control)无明显差异。Western blot和qPCR结果显示,ASXL3干扰后可以促进SOCS3的表达,同时可以抑制PSD95的表达。结论1、染色体微阵列技术和高通量测序技术在胎儿结构异常家系分析中有重要的价值。2、RNA-seq测序技术可以用来探索性的候选基因及其信号通路上与之相互作用的基因。3、ASXL3可以调控SK-N-SH细胞中SOCS3和PSD95的表达。
【图文】：

流程图,实验操作,流程,探针

图 1-1 DNA 质控电泳图谱3.5 染色体微阵列分析（CMA）本次实验采用的是Affymetrix公司提供的CytoScan HD芯片，该芯片包含了1万个 CNV 探针以及 75 万个 SNP 探针，在基因内平均每 880bp 就含有 1 个探针其中的 CNV 探针几乎覆盖了全基因组，对于＞400kb 的基因组拷贝数变异的检率达 99%；而 SNP 探针对 SNP 分型的准确率＞99%。该探针包含 340 个 ISCA因、526 个癌基因、177 个 X 染色体上的 OMIM 致病性基因，同时覆盖了 2640的OMIM 致病性基因以及 36121 个 UCSC 数据库的 RefSeq 基因。可精确检测出贝数变异（CNVs）、杂合性缺失(LOH)、单亲二倍体(UPD)以及低水平的嵌合体样品异质性。目前按照公司提供的标准化的实验操作流程，进行全基因组 DNA消化、连接、扩增、纯化、片段化、标记、杂交、扫描以及数据分析。具体操作图1-2。

电泳图谱,产物,离心管,磁珠

图1-3 PCR 产物质检的电泳图谱PCR 产物纯化1 标记新的 1.5mL 离心管，将上述 PCR 反应后的扩增产物转移至2 从 4℃冰箱内取出磁珠，，上下混匀后分别向各个离心管中加入 7倒混匀 10 次，室温静置 10 分钟，16100 rcf 离心3 分钟。3 将离心后置于磁力架上，吸去上清液；加入 1ml Purification Wash 沫振荡器中上下震荡 2 分钟；然后 16100 rcf 离心3 分钟；4 将离心后的离心管置于磁力架上，吸去上清液；16100 rcf 离心上，待磁珠完全被吸附后，不触碰磁珠，用 20μl 移液器尽量吸5 打开离心管盖子，室温下静置 10 分钟，待离心管内剩余的液体挥
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332

【参考文献】