弓形虫移动联结复合物成员棒状体颈部蛋白TgRON4L1，TgRON4的补偿功能研究

发布时间：2020-05-12 11:57

【摘要】：弓形虫是一种专性胞内寄生的顶复门原虫,几乎能在所有恒温动物(鸟和哺乳动物)的有核细胞内建立感染,由其引起的弓形虫病在世界范围内广泛分布与流行。近年来,随着免疫缺陷型患者的增多,弓形虫病的发病率也呈不断上升趋势。弓形虫入侵宿主细胞时在虫体与宿主细胞膜接触处形成移动联接复合物(MJ)来帮助虫体锚定于宿主细胞表面并帮助虫体完成入侵过程。目前已知的MJ复合物成员棒状体颈部蛋白(RON)2,4,5的功能已有相应的研究报道,但其间蛋白的相互作用模式还尚不清楚。其中TgRON4作为入侵的关键分子,已有研究表明敲除该分子影响虫株入侵率但并不致死。通过同源性比对,我们找到TgRON4的同源基因TgRON4L1,探究其在TgRON4缺失时是否对虫体入侵起到一定的补偿作用。本研究根据弓形虫基因组数据库ToxoDB中TgRON4L1的基因序列的分析结果,截短部分序列进行扩增,原核表达制备了 TgRON4L1的多克隆抗体,检测到TgRON4L1在虫体入侵时定位于移动联接复合物上。体外真核细胞表达移动联接复合物成员TgRON4和同系物TgRON4L1以及TgRON5,通过免疫共沉淀试验发现TgRON4L1,TgRON4与TgRON5有直接相互作用。为进一步探究TgRON4L1的功能,我们通过CRISPER/Cas9技术敲除弓形虫速殖子阶段的TgRON4L1基因,筛选获得单克隆虫株,发现缺失TgRON4L1不影响虫体入侵及逸出宿主细胞和宿主细胞内复制的能力,而在TgRON4缺失虫株中,TgRON4L1的表达量却明显上调。以上结果说明弓形虫棒状体颈部蛋白TgRON4L1是弓形虫移动联接复合物上的成员,并且其在功能上与TgRON4有着一定的补偿作用。
【图文】：

根据下载的ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ基因序列设计引物经ＰＣＲ扩增Ｎ端（邋１０００－１５０３邋ｂｐ）和Ｃ逡逑端（３００１－４００２邋ｂｐ）基因序列，，ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图所示扩增逡逑出ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ邋５００邋ｂｐ及ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｃ１０００ｂｐ左右目的条带（图１）。逡逑

Ｍ逦Ｍ逡逑（■ｍｍ邋５０００邋ｂｐ逡逑Ｉ邋３０００邋ｂｐ逡逑Ｉ邋２０００邋ｂｐ逡逑１５００邋ｂｐ逡逑８００邋ｂｐ逡逑￡－逦Ｉ邋５００邋ｂｐ逡逑３００邋ｂｐ逡逑图１邋ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ／Ｃ截短基因的ＰＣＲ扩增结果逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ／Ｃ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑２邋ｐＧＥＸ４Ｔ－３－ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ邋重组质粒的鉴定逡逑的片段连接于内切酶Ｘｈｏｌ和ＢａｍＨＩ处理的ｐＧＥＸ－４Ｔ－３载体，经１％琼脂定（图２），回收载体片段。扩增的ＴｇＲＯＮ４Ｌｌ－Ｎ／Ｃ截断片段与回４Ｔ－３进行同源重组后，菌落ＰＣＲ鉴定如图均为阳性克隆（图３）。逡逑Ｍ逡逑
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7;R382.5

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 赵禹;孙晓林;朱兴全;周东辉;;顶复门原虫棒状体颈部蛋白研究的新进展[J];中国人兽共患病学报;2015年08期

2 徐颖;高琦;徐前明;朱兴全;;弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白研究的新进展[J];中国人兽共患病学报;2013年12期

本文编号：2660182