猪胎儿肾脏发育阶段的研究与Pax2基因敲除猪细胞系的制备

发布时间：2020-05-12 22:15

【摘要】：研究背景随着终末期肾病患者数量不断增加,肾移植供体短缺问题受到研究人员的广泛关注。利用诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和囊胚互补技术在动物体内再生人源化肾脏,有望成为人类肾脏移植供体来源的新途径。通过该方法再造人源化肾脏的前提是要获得肾脏缺失的动物模型。猪在解剖结构、生理功能和器官大小上都与人有着高度的同源性且资源丰富,被认为是可以为人iPSC发育分化提供微环境的理想动物。配对盒基因2(Paired box2,Pax2)是哺乳动物胚胎肾脏发育过程中重要的转录因子,广泛表达于前、中、后肾的发育过程中,并且与多种调节肾脏发育的因子相互作用,共同精确诱导生肾索形成、中肾管的形成和分化、输尿管芽的生长和分支以及后肾间充质的分化等。Pax2基因突变会导致小鼠肾脏缺失。然而,不同物种的肾脏发育过程以及相关信号分子的表达在时间和空间上都存在着差异,因此探究猪的肾脏发育过程以及肾脏发育过程中Pax2等信号分子的表达情况,制备Pax2基因敲除的猪细胞系,为后续构建肾脏缺失或缺陷的猪模型奠定了实验基础,也为将来在猪体内再生人源化肾脏提供了一定的理论依据。目的明确不同时期猪胎儿肾脏的发育情况,研究猪胎儿肾脏发育过程中相关信号分子的表达水平,利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated system)基因编辑技术制备Pax2基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系。方法收集不同时期(胎龄为21.5天、27.5天、35天、45天、75天及110天)的猪胎儿肾脏组织,应用苏木精-伊红染色法(hematoxylin and eosin staining,HE染色)观察不同时期猪胎儿肾脏的组织结构。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)分别检测猪肾脏发育相关信号分子(Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4)的mRNA及蛋白表达水平,并进一步利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法检测Pax2在不同时期猪胎儿肾脏中的表达定位情况。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计用于巴马小型猪Pax2基因敲除的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA)并构建CRISPR/Cas9打靶载体,将打靶载体与pCMV-tdTomato质粒(含G418抗性)共同转染到原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,经G418药筛获得单克隆细胞并进行基因型鉴定,最终确定Pax2基因成功敲除的细胞系。结果27.5d时,猪胎儿的后肾已经开始发育;35d时,早期肾小体已经出现,肾小管已经开始发育;45d可观察到近皮质不成熟的肾小体和近髓质成熟的肾小体;75d时,肾单位数目显著增加,可以观察到肾椎体、肾乳头和肾盂;110d时,肾脏基本发育成熟,皮髓质分界明显,但仍有新的肾单位产生。qRT-PCR和WB结果显示,75d的猪胎儿肾脏中Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4基因的mRNA和蛋白表达量高于35d的表达量。通过免疫组化实验进一步分析27.5d、35d、45d、75d和110d时期Pax2蛋白的表达定位情况,结果显示,Pax2广泛表达于输尿管芽、后肾间充质、帽状间充质、肾小囊体、逗号形体、S形体以及肾小管,并在后肾发育过程中持续表达。设计了巴马小型猪Pax2基因的sgRNA并构建了CRISPR/Cas9打靶载体,转染原代猪胎儿成纤维细胞经G418药筛后获得73个单克隆细胞,经鉴定,40个克隆发生突变,突变效率为54.8%,其中Pax2双等位基因敲除的细胞克隆有33个,可用于下一步体细胞克隆实验,双等位基因敲除效率为45.2%。因此,本实验成功制备了Pax2基因敲除的猪细胞系,为Pax2基因敲除猪模型的构建奠定了实验基础。
【图文】：

形态图,形态图,不同时期,重量

南京医科大学硕士学位论文实验结果1.不同时期猪胎儿肾脏的形态学分析为探究不同时期猪胎儿肾脏的发生发育情况，我们分别对胎龄21.5d、27.5d、35d、45d、75d 和 110d 的猪胎儿进行解剖，收集肾脏样本。在 21.5d 和 27.5d 的猪胎儿体内，未发现具有典型肾脏形态的肾脏器官。对 35d、45d、75d 及 110d 的猪胎儿进行解剖，均获得了具有典型肾脏形态的肾脏器官。所获得的猪胎儿肾脏呈长而扁的蚕豆形，表面光滑。随着猪胎儿发育时间的延长，其肾脏的体积逐渐增大、重量逐渐增加，测量结果显示，35d 猪胎儿肾脏长约 4.0mm，重量约 0.0148g；45d 猪胎儿肾脏长约 8.5 mm，重量约 0.0627 g；75d 猪胎儿肾脏长约 24.5 mm，重量约 2.2267 g；110d 猪胎儿肾脏长约 36.6 mm，重量约 42.0067 g（图 1）。

发育情况,血管球,肾小体,肾小囊腔

层的较成熟的肾小体；肾小囊体位于生肾区的浅表部分，而在生肾区较深部见 S 形体；在生肾区下方，小的血管球被丰富的间充质细胞包绕，皮髓质连的较大的血管球有明显的毛细血管簇和更宽阔的肾小囊腔；肾小管数量增多构进一步完善（图 4A、B、C、D）。75d，皮质明显变得更宽并且包含更多球，血管球毛细血管数量增多，，肾小囊腔增大；集合管形成，管腔较大；近单位发生较早，随着集合小管末端不断向皮质浅层生长并分支，不断诱导后充质形成浅表肾单位；生肾区明显变薄，可见少量的肾小囊体和较多的 S ；近端小管和远端小管结构更加复杂完善，数量显著增加；可以观察到肾椎体乳头、肾大盏、肾小盏和肾盂（图 5A、B、C、D）。110d，肾脏发育基本成熟构基本完善；肾小体形态清晰完整，肾小管在肾小体周围紧密排列，周围间胞减少；皮质髓质分界清楚，可观察到髓放线；生肾区有少量 S 形体，仍有肾单位形成（图 6A、B、C、D）。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R699.2

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