寨卡病毒通过靶向MAVS和MITA蛋白逃逸宿主天然免疫反应的机制研究

发布时间：2020-05-17 12:43

【摘要】：目的:近年来ZIKV疫情在全球多个国家和地区的爆发引起了人们的极大关注。在流行疫区,受感染人群中新生儿小头畸形症和成人格林-巴利综合征的比例显著增加,表明其可能具有严重的神经毒性。然而目前还没有疫苗或特效药物可以针对性的预防或治疗ZIKV感染引起的疾病,因此明确ZIKV的发病机制迫在眉睫。有研究指出ZIKV不能引起机体产生快速而强烈的天然免疫反应,提示ZIKV可以通过某种策略逃避宿主细胞的抗病毒免疫反应。目前在探究寨卡病毒免疫逃逸机制方面取得了一定进展,但关于介导寨卡免疫逃逸的病毒蛋白及其分子机制尚未完全阐明。此外,ZIKV非洲系和亚洲系两大世系间基因序列存在差异性,这种差异可能使其与宿主之间产生了新型且多样的相互作用,从而表现出独特的先天免疫应答和致病性。然而相比于以MR766为代表的非洲病毒株,当代亚洲系病毒株研究较少。本课题以2016年从中国广州输入的当代亚洲株SZ-WIV01为对象,研究其逃避宿主天然免疫的分子机制。方法:1.SH-SY5Y细胞系被SZ-WIV01寨卡病毒株感染后,通过RT-PCR及ELISA实验探究SZ-WIV01对I型IFN(IFNβ)的抑制作用。2.构建SZ-WIV01病毒株3种结构蛋白(C,M,E)、7种非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS2B3,NS4A,NS4B,NS5)以及蛋白酶复合体NS2B3的真核表达质粒并瞬时转染入HEK293T细胞中,通过Western Blot实验验证其在真核细胞中的表达情况。3.将病毒蛋白表达质粒分别瞬转入HEK293T细胞中,通过RT-PCR、双荧光素酶报告实验等技术检测其对IFNβ及CCL5、ISG15等干扰素刺激基因的抑制情况,以筛选出参与SZ-WIV01免疫逃逸过程的关键病毒蛋白。4.构建RLRs信号通路中RIG-I、MAVS、MITA、TBK1、IRF3等主要作用元件及其激活体的真核表达质粒,通过RT-PCR、ELISA、Western Blot、免疫共沉淀、免疫共聚焦等实验技术探究SZ-WIV01及其病毒蛋白对RLRs通路中的各蛋白的影响,以初步确定可与病毒蛋白相互作用的通路靶蛋白。5.根据功能分区,构建病毒蛋白及通路靶蛋白的截短体或点突变体,Western Blot实验验证其在真核细胞中的表达情况,通过免疫共沉淀实验探究病毒蛋白与通路靶蛋白相互作用的具体结合区域。6.通过RT-PCR、Western Blot等探究SZ-WIV01及其病毒蛋白对通路靶蛋白表达的影响。7.通过Western Blot、泛素化等实验探究SZ-WIV01及其病毒蛋白对通路靶蛋白泛素化等翻译后修饰的影响。结果:1.SZ-WIV01病毒可以显著抑制IFNβ及其下游ISGs的产生,以逃避宿主天然抗病毒免疫反应。2.所构建SZ-WIV01病毒株各蛋白、RLRs通路各蛋白及其截短体质粒在真核细胞中成功表达。3.SZ-WIV01非结构蛋白NS3和NS2B3显著抑制poly(I:C)诱导的IFNβ、ISGs表达以及IRF3蛋白的核易位过程。4.NS3和NS2B3病毒蛋白分别通过靶向并结合MAVS和MITA蛋白来抑制RLRs通路信号传递,发挥其干扰素拮抗作用。5.NS3与MAVS的结合依赖于NS3(aa 181-480)和MAVS(aa1-180)或(aa361-540),而NS2B3(aa1-310)与MITA(aa1-379)发生蛋白相互作用。6.NS3和NS2B3分别特异性的抑制MAVS和MITA的蛋白表达。进一步的截短体实验表明,过表达NS3时,MAVS(aa 361-540)发生表达下调,而MAVS(aa 1-180)和MAVS(aa 181-360)则能够避免这种抑制作用。同时NS2B3的过表达可以明显下调MITA-C(aa 174-379)蛋白表达,但对MITAN(aa 1-173)影响不大。7.NS3和NS2B3分别在蛋白水平而非m RNA水平调控MAVS和MITA的表达。同时蛋白酶体抑制剂MG132显著逆转了这种抑制,表明这一过程主要由蛋白酶体途径介导。8.NS3和NS2B3分别通过催化MAVS和MITA的K48泛素化修饰来促进其发生降解。9.NS2B3还可通过下调MITA的K63泛素化修饰来抑制RLRs通路信号的传递。结论:ZIKV病毒株SZ-WIV01能拮抗I型IFN及ISGs的产生并对MAVS和MITA的表达产生抑制作用。机制上,SZ-WIV01的病毒蛋白NS3和NS2B3可分别靶向并结合MAVS和MITA蛋白,并依赖K48介导的泛素-蛋白酶体系统促使它们发生降解。此外,NS2B3可通过抑制MITA的K63泛素化修饰来负反馈调节RLRs通路的信号传导,从而拮抗I型IFN的产生。我们的研究揭示了ZIKV逃避先天免疫反应的未被发现的机制,为疫苗或有效药物的临床研究提供新的见解。
【图文】：

图 1. SZ-WIV01 寨卡病毒株显著抑制 IFNβ 及 ISGs 的表达 (A) SH-SY5Y 细胞经 SZ-WIV01 病毒(1 MOI)感染 3 h 后，去除病毒接种物并洗涤后更换新鲜的 DMEM 高糖培养基继续孵育，，分别于 24 h 48 h 及 72 h 后收取细胞上清 以 Vero 细胞为媒介做标准病毒噬斑实验，检测细胞上清液中病毒滴度值 滴度表达单位为 pfu /ml

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文核细胞中正常表达(图 2-1) 其中，NS2B3 病毒蛋白被检测出含有三条大小的条带 这是由于 NS2B3 具有蛋白酶活性，可对自身进行酶切，这也从侧实了此次构建的 NS2B3 蛋白成功保留了其蛋白酶生物学功能
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2668568