高效氯氰菊酯胁迫下冈田绕眼果蝇CYP450基因表达特征研究

发布时间：2020-05-17 15:12

【摘要】：目的:通过高效氯氰菊酯胁迫遵义地区冈田绕眼果蝇(Phortica okadai,P.okadai),研究其细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)基因的表达特征,为媒介昆虫对菊酯类杀虫剂的代谢抗性机制研究奠定基础。方法:1.建立P.okadai动物模型:在遵义周边地区诱捕P.okadai,形态学初步鉴定后进行实验室饲养,进一步通过体视镜、扫描电镜等对其卵、幼虫、蛹、成虫四个阶段进行形态学研究,并利用细胞色素C氧化酶亚基1(cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)基因进行分子鉴定。2.高效氯氰菊酯胁迫下P.okadai的毒力测定:参照GB/T26350-2010版《蝇类抗药性检测方法家蝇生物测定法》,通过药膜法检测高效氯氰菊酯对P.okadai(实验室饲养未接触任何杀虫剂、羽化3-5 d未交尾的雌蝇)的毒力。3.内参基因筛选:结合课题组前期构建的转录组数据库,挑选18S RNA、EF-1α、GAPDH、β-Actin和β-Tublin五个候选内参基因,通过荧光定量PCR检测,结合△Ct值分析、GeNorm软件分析、NormFinder软件分析和BestKeeper分析四种方法,确定P.okadai在高效氯氰菊酯胁迫下表达稳定的内参基因。4.结合课题组前期构建的转录组数据库,挑选四个与对菊酯类杀虫剂代谢抗性相关的CYP450基因,以筛选到的β-Tublin基因作为内参基因,通过荧光定量PCR分析候选CYP450基因在高效氯氰菊酯LC_(20)(0.061mg/L)胁迫下七个时间点(0、1、2、4、8、12、24 h)的表达差异。5.高效氯氰菊酯胁迫下P.okadai CYP450酶系基因表达差异研究:通过转录组测序比较P.okadai在高效氯氰菊酯作用0 h和1 h CYP450酶系基因的表达差异,并挑选部分CYP450基因进行荧光定量PCR验证。结果:1.遵义地区P.okadai与中国安徽等其他地区P.okadai形态学上无明显差异,二者cox1基因序列一致性为100%;与欧美的变色伏绕眼果蝇(Phortica variegata,P.variegata)形态学上无明显差异,与意大利P.variegata的cox1基因序列一致性为98%。2.毒力回归计算结果表明,高效氯氰菊酯作用于P.okadai的LC_(20)为0.061 mg/L。3.荧光定量PCR结果显示,五个候选内参基因中,β-Tublin基因是高效氯氰菊酯胁迫研究的最适内参基因。4.荧光定量PCR结果表明,四个CYP450基因均在胁迫1 h时就出现显著表达差异(P0.05),其中cyp9f2基因表达显著升高,其他三个基因表达显著降低。5.转录组测序分析显示高效氯氰菊酯胁迫P.okadai 1 h时,差异表达的CYP450基因有103个。以差异倍数|log_2~(Ratio)|≥1和q值0.05为标准,筛选出差异表达的CYP450基因有21个,其中表达上调基因5个,表达下调基因16个;荧光定量PCR验证结果与转录组测序结果一致。结论:1.遵义地区P.okadai与P.variegata形态学上一致,但基于cox1基因进行系统进化分析显示二者存在一定差异。2.高效氯氰菊酯胁迫下P.okadai的LC_(20)为0.061 mg/L,表达稳定的内参基因是β-Tublin基因。3.低浓度高效氯氰菊酯胁迫1 h以内,P.okadai对杀虫剂的代谢可能与cyp28d1、cyp28d2、cyp4d2以及cyp49a1等CYP450基因表达上调相关。
【图文】：

科大学硕士学位论文 验方法外诱捕。组前期调查 T. callipaeda 患者主要分布在遵义地区的正安、绥国贵州省遵义市，27°13'15″-28°04'09″N ，106°17'22″-107°26'2有感染病例，该地区的海拔高度在 800 至 1300 米之间（图 1-1）遵义市红花岗区董公寺镇汇川国际温泉城附近梨园，参考王增 2×1×1 cm 大小果块儿于 20-30 ℃环境自然发酵"g24 h，倒出果包，悬挂于距离地面 1 m，待蝇子前来觅食时用提前用纱布和果包一同取下，等待鉴定。

蝇（图 1-2），停落时呈长椭圆形的双翅重腹果蝇相比明显较大，较易区别。复眼周边（图 1-3A）；胸背部多个褐色暗斑（图 1-于中央和侧缘向前延伸，形成“山”字形（图分枝毛较短（图 1-3D）；雌、雄蝇皆具一对衡棒，翅瓣较小，前翅亚前缘脉退化，有 三与第四纵脉，第四与第五纵脉，，中部具有色环带（图 1-3G）; 雄蝇果蝇腹部分 10连的侧臂组成，外生殖器位于腹侧后端（图的端突与基突，形成似手握之半环形（图 1-3J）。义地区分布的 P. okadai，经安徽医科大学王研究的 A. okadai (P. okadai)在形态学上一致
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R384.2

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本文编号：2668755