携带Lipocalin 2基因重组减毒沙门氏菌的构建及其对分枝杆菌生长影响的研究

发布时间：2020-05-21 05:26

【摘要】：目的:1.构建和鉴定脂质运载蛋白2(Lipocalin 2,Lcn2)基因重组减毒沙门氏菌。2.探讨携带Lipocalin 2的减毒沙门氏菌对分枝杆菌生长的影响。方法:1.以巨噬细胞RAW264.7提取RNA逆转录为c DNA为模版,采用PCR法扩增Lcn2基因,定向克隆到质粒p Bud CE4.1-orim的多克隆位点中,构建重组质粒p Bud CE4.1-orim-Lcn2;将重组质粒p Bud CE4.1-orim-Lcn2转染RAW264.7细胞,用RT-q PCR法检测Lcn2的m RNA表达。2.将重组质粒转入减毒沙门氏菌SL7207得到重组菌株SL7207-p Bud CE4.1-orim-Lcn2;重组菌感染RAW264.7细胞,用Western blot检测Lcn2的蛋白表达,RT-q PCR法检测Lcn2的m RNA表达;7H10平板上通过菌落计数观察重组菌对感染RAW264.7细胞的BCG生存的影响。3.用重组菌以灌胃的方式感染BALB/c小鼠后,检测脾组织中Lcn2表达,血清中IFN-γ和IL12的水平。4.建立BCG小鼠感染模型,以重组菌治疗后通过肺组织荷菌量和肺组织病理变化观察其对分枝杆菌生长的影响。结果:1.成功构建Lipocalin 2基因重组质粒,经双酶切及基因测序鉴定正确。重组质粒转染RAW264.7后用RT-q PCR法检测Lcn2的m RNA表达升高(P=0.000,F=22570)。2.成功构建重组菌株SL7207-p Bud CE4.1-orim-Lcn2,经PCR鉴定正确。重组菌感染RAW264.7细胞Lcn2的蛋白表达量较对照组增加(P=0.000)。RT-q PCR法检测重组菌m RNA表达较对照组明显升高(P=0.000,F=5.281)。7H10平板上重组菌组BCG数量与空载菌组相比明显减少(P=0.000,F=11.41)3.重组菌组与空载对照菌组相比小鼠脾组织Lcn2表达升高(P=0.000,F=4.449),重组菌组与生理盐水组相比血清IFN-γ升高(P=0.004,F=15.27),IL12未见明显差异(P0.05,F=2.26)。4.空载菌组、重组菌组小鼠肺荷菌量分别为6.27±0.33log10、6.21±0.29log10。空载菌组与重组菌组肺荷菌量比较无统计学差异(P0.05,F=1.30)。空载菌组、重组菌组肺组织病理变化未见明显差异。结论:1.成功构建了携带Lcn2基因的重组减毒沙门菌。2.重组菌感染RAW264.7细胞后Lcn2的表达增加,对感染RAW264.7的BCG存活起到一定的抑制作用。3.重组菌以灌胃的方式感染小鼠后,小鼠脾组织Lcn2表达增加,血清IFN-γ含量增加,血清IL-12含量未见明显变化,提示小鼠免疫状态有利于结核病转归。4.重组菌治疗BCG感染小鼠后,小鼠肺部BCG荷菌量与对照组无明显差异,肺部病理变化无明显差异。
【图文】：

1.DNA 标准（DL2000）;2.PCR 产物 1.DNA 标准（DL200）;2、3.双酶A.PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 pBudCE4.1-orim-Lcn2B.酶切鉴定图 1 pBudCE4.1-orim-Lcn2 质粒鉴定Fig.1 Identification of the pBudCE4.1-orim-Lcn2 plasmid2 重组质粒 pBudCE4.1-orim-Lcn2 的测序结果将酶切鉴定正确的重组质粒 pBudCE4.1-orim-Lcn2 送至成都擎科生物技术公司进行测序，结果显示重组质粒构建成功（图 2）。

图 2 重组 pBudCE4.1-orim-Lcn2 的测序鉴定Fig.2 Sequencing result of the recombinant plasmid of pBudC2 在 RAW264.7 细胞中的表达水平分析△Ct比较 Lcn2 mRNA 相对表达水平，以空载体质粒 L结果显示重组质粒、空载体质粒、空白对照的组织表1.18、1.005±0.074、0.6904±0.0262（P=0.000，，F=2257对照组（图 3）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378

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本文编号：2673784