【摘要】：钾通道是功能性表达在细胞膜上允许K~+跨膜通过的离子通道,钾通道广泛存在于骨骼肌、心脏、神经、胃肠道和淋巴细胞中,是目前发现的功能最复杂、亚型最多的一类离子通道。Kv1.3是一种电压门控钾通道,在淋巴细胞中高表达,现有研究表明:Kv1.3参与了人体自身免疫性疾病的发生发展,在自身免疫性疾病患者中,Kv1.3在外周血TEM细胞中和患处的表达量高于正常人;在多发性硬化症、牛皮癣和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病动物模型中,Kv1.3抑制剂表现出对其动物模型很好的治疗效果,目前已有一种Kv1.3的多肽毒素抑制剂已经针对牛皮癣的治疗进入临床II期。自身免疫性疾病主要包括牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化症、1-型糖尿病和克罗恩等疾病,现有的针对自身免疫性疾病的治疗方式主要为广谱的免疫抑制剂和抗炎药物。虽然这些药物在一定程度生能够缓解自身免疫性疾病的病情,但是这些药物也存在一个明显的副作用,就是这些药物没有明确的作用靶点,在缓解病情的同时也会对身体其他组织器官造成伤害。所以,急需有明确靶点的药物进入自身免疫性疾病治疗领域。虽然有许多靶向于Kv1.3的药物已经发现并应用于临床,但在药物的筛选上,还需要发现更多的亲和性更强,选择性更好的靶向于Kv1.3的药物。不仅如此,在Kv1.3与更多的自身免疫性疾病的关系阐述上还有待更深入的研究。本研究利用本实验室以前从雷氏大疣蛛中发现的一种Kv1.3抑制剂RTX-Ⅷ展开了与自身免疫性疾病相关的研究。RTX-Ⅷ含有35个氨基酸残基,其IC50值为36.3 nM,含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键。首先通过化学合成的方式合成了RTX-Ⅷ,但由于复性产率较低,只占线性多肽的15%左右,故后续又采用大肠杆菌原核表达的方式获取RTX-Ⅷ,采用PET43a(+)载体和Shuffle菌种,表达的RTX-Ⅷ具有和野生型RTX-Ⅷ同样的活性,表达量为15 mg/L。获取了足够的RTX-Ⅷ用于后续自身免疫性疾病动物模型实验。虽然RTX-Ⅷ具有对Kv1.3很好的选择性和亲和力,但RTX-Ⅷ是否对于自身免疫性疾病模型有很好的治疗效果还需进一步验证。于是,构建了科学家已经证明过的Kv1.3抑制剂具有很好药效的多发性硬化症大鼠模型(实验性脑脊髓炎,EAE)和K14-VEGF牛皮癣小鼠模型来评价RTX-Ⅷ的药效。实验结果表明:1 mg/kg的RTX-Ⅷ对EAE模型大鼠表现出很好的治疗效果,并且能够降低模型治疗组中炎性因子的分泌;紧接着,又利用K14-VEGF牛皮癣小鼠来评价RTX-Ⅷ对牛皮癣的治疗效果,结果表明:RTX-Ⅷ同样对牛皮癣小鼠具有很好的治疗效果。在RTX-Ⅷ的药物代谢动力学和毒性实验中,研究发现RTX-Ⅷ在大鼠体内30 min时达到峰值,而在1 h时就会被降解完全,且RTX-Ⅷ主要通过大鼠的肝脏进行代谢,少部分通过大鼠肾脏进行代谢,即使RTX-Ⅷ通过大鼠的肾脏和肝脏进行代谢,但是在有效剂量100倍的情况下,RTX-Ⅷ并不对小鼠的肝脏和肾脏产生明显的毒副作用,并且不影响老鼠的行为学。虽然Kv1.3与多发性硬化症、牛皮癣等自身免疫性疾病的关系已经清楚,但Kv1.3与克罗恩病的关系还需进一步深入研究。所以首次研究了Kv1.3与克罗恩疾病的关系。1、从临床水平:从临床确诊为克罗恩病人和正常人的外周血中分离TEM细胞,通过膜片钳记录TEM细胞上Kv1.3的电流,从而计算功能性表达在膜上的Kv1.3的数量,我们发现:在克罗恩病人中Kv1.3的表达量相比于正常人要高三倍,通过RT-qPCR检测K1.3的mRNA在克罗恩病人和正常人的表达量,同样发现在mRNA水平,在克罗恩病人中的表达量要比正常人高5倍左右,通过免疫组化检测克罗恩病人肠粘膜和正常人肠粘膜样本,发现在克罗恩病人肠粘膜中Kv1.3的表达量要高于正常人组;结果确认Kv1.3在克罗恩病人中高表达。2、从动物模型水平:建立大鼠克罗恩疾病模型,利用RTX-Ⅷ作为药物治疗模型组大鼠,结果发现:1 mg/kg和2 mg/kg的RTX-Ⅷ能够在一定程度上缓解大鼠克罗恩症状,并且能够在体内降低大鼠Kv1.3在mRNA和蛋白质水平的表达。RTX-Ⅷ能够降低大鼠体内IL-2、TNF-a、IFN-g和IL-17A等炎性因子的分泌,其药效和临床药物英夫利昔单抗的药效基本一致。结果表明:RTX-Ⅷ对克罗恩病的治疗效果和英夫利昔单抗的治疗效果基本一致。由于现有的Kv1.3的多肽毒素抑制剂已经发现很多,尤其是在蝎子和海葵毒液中发现了大量的Kv1.3抑制剂,而在蜘蛛毒素中发现的Kv1.3抑制剂很少,不仅如此,在蝎子和海葵中的Kv1.3多肽毒素抑制剂对Kv1.3的IC50极低,通常在皮摩尔水平,而我们发现的RTX-Ⅷ相比于现有的多肽毒素也具有很明显的优势:1、现在进入临床的来自于海葵中的多肽毒素ShK-186,是基于海葵多肽毒素ShK进行修饰的多肽,进行修饰后的ShK-186对Kv1.3的IC 50为71±4 pM,对Kv1.1的IC50为7±0.5 nM,其选择性约为97倍。而RTX-Ⅷ对Kv1.3的IC50为36 nM,对Kv1.1的IC50大于100mM,其选择性大于3000倍,且RTX-Ⅷ为未经任何修饰改构的天然多肽,其选择性明显要优于ShK-186。2、ShK-186的修饰是在ShK的C端偶联上酰胺化合物,在第23个氨基酸改为甲硫氨酸,在N端加上一个磷酸化的酪氨酸,所以其样品的获得一定得依赖化学合成获得,而又因为本身含有三对二硫键,又要对合成的样品进行二硫键的连接。而RTX-Ⅷ可以通过基因工程表达获得大量的样品。所以,在样品的获得上,RTX-Ⅷ具有比ShK-186更大的优势。综上所述,本研究通过原核表达成功表达了Kv1.3的多肽抑制剂RTX-Ⅷ,并证明RTX-Ⅷ在EAE和牛皮癣动物模型中表现出很好的治疗效果,首次阐述了Kv1.3与克罗恩疾病的关系,并证明了Kv1.3抑制剂在大鼠克罗恩疾病模型中表现出很好的治疗效果,丰富了人们对克罗恩与Kv1.3的关系的认识。
【图文】：
图 1. Kv1.2 通道蛋白质晶体 X 射线衍射及三级结构。A：Kv1.2 通道蛋白质晶体 X 射线射。白色为晶格，，蓝色显示电子密度。B：Kv1.2 通道结构示意图。红色为 亚基，蓝色为 基[27]。
图 1. Kv1.2 通道蛋白质晶体 X 射线衍射及三级结构。A：Kv1.2 通道蛋白质晶体 X 射线射。白色为晶格，蓝色显示电子密度。B：Kv1.2 通道结构示意图。红色为 亚基，蓝色为 基[27]。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965;R-332
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本文编号：
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