弓形虫感染诱导的DC2.4树突状细胞外泌体差异性miRNA特性研究

发布时间：2020-05-25 02:18

【摘要】：背景:弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生原虫,可感染人类和其他温血动物,感染后可以经血液迅速散播到所有组织器官。弓形虫的感染刺激免疫细胞快速产生IL-12和IFNγ。外泌体是由细胞释放的细胞外囊泡的一种亚群,粒径大小在30-150nm之间,在细胞间的通讯中起着重要作用。在外泌体中,已经检测到蛋白质、脂质、mRNA或miRNA的特定大分子。外泌体在被靶细胞摄取后,其本身富集的成分会对靶细胞产生影响,起到对靶细胞的调节作用。树突状细胞(Dendritic Cells,DC)是免疫细胞的一种,是功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟DC具有较强的迁移能力,成熟DC能有效激活初始T细胞,在免疫系统中有着不可或缺的作用,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。MicroRNA(miRNA)是一类长度约20-24个核苷酸的小RNA,参与调控基因表达并且能够参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育,细胞增殖,细胞凋亡和死亡。方法:体外培养收集RH株弓形虫速殖子,并感染DC2.4细胞(MOI=3)28小时。收集未感染组树突状细胞外泌体(DC-EXO)、感染弓形虫组树突状细胞外泌体(Tg-DC-EXO),并提取外泌体总RNA,进而采用高通量测序的方法对两组细胞外泌体进行miRNA表达谱分析,分析来自这两个细胞群的外泌体中差异表达的miRNA。分析这些miRNA的靶基因,并对靶基因进行GO(Gene ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)途径分析。结果:应用DEGseq对基于测序的差异基因进行检测,通过多重假设检验校正,对于符合差异在两倍及以上且Q-value值小于等于0.001,认为是显著的差异表达基因,总共获得3,434个差异表达的miRNA,并从中筛选出差异显著且稳定的19个miRNA。这些差异表达的miRNA对应的靶基因涉及多种生物过程和途径,与免疫系统进程和细胞生长以及细胞间通讯相关。结论:弓形虫感染DC2.4后,导致细胞外泌体中富集的miRNA谱发生变化,而这些变化的miRNA与免疫系统的进程有着关联,特别是T细胞信号传导通路,这使得这些差异表达的miRNA在研究免疫系统对弓形虫感染所产生的反应上显得至关重要,也说明这些miRNA有作为检测或预后靶标的潜力。
【图文】：

测序,高通量,差异表达,数据分析

图１外泌体ｍｉＲＮＡ的高通量测序数据分析流程逡逑２．３．２差异表达ｍｉＲＮＡ的筛选方法逡逑ＲＮＡ测序是一个随机的过程，每一条序列都是均匀随机的来自各自的样品。逡逑因此可以认为每一个基因的表达量服从二项分布或者泊松分布。首先我们根据逡逑二项分布来评估，而每个基因的ｐ值可以用Ｑｖａｌｕｅ进行多重假设检验校正，对逡逑于符合差异在两倍及以上且Ｑ－ｖａｌｕｅ值小于等于０．００１，认为是显著的差异表达逡逑基因。我们的实验设置了多个重复，考虑到目前的研究情况，传统的ＲＮＡ－ｓｅｑ逡逑１８逡逑

弓形虫,虫株,效率,感染复数

况先进行弓形虫的感染实验，采用ＲＨ－ＧＦＰ绿色荧光的弓形虫虫株对树突状细逡逑胞ＤＣ２．４进行感染复数为３的弓形虫感染实验，来判断弓形虫ＲＨ虫株对树突逡逑状细胞ＤＣ２．４的侵袭效率。从图１中我们可以看到在感染复数为３的情况，基逡逑本上每个树突状细胞都有弓形虫速殖子入侵。逡逑Ｂｒｉｇｈｔ逦ＧＦＰ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑—逡逑图１用ＲＨ－ＧＦＰ感染评估弓形虫ＲＨ虫株对ＤＣ２．４的侵袭效率（ＭＯＩ＝３邋Ｘ４０本文使用ＧＦＰ－ＲＨ来评估弓形虫ＲＨ株对ＤＣ２．４细胞的侵袭效率。以感染复数（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，邋ＭＯＩ）为３进行感染，在荧光显微镜下观察ＤＣ２．４细胞中弓形虫荧光速殖子的逡逑侵袭状况。在镜下我们可以观察到，基本上每个细胞都被ＧＦＰ－ＲＨ侵入，，表明弓形虫ＲＨ逡逑株可有效感染ＤＣ２．４细胞，而对比正常ＤＣ２．４细胞的形态，被弓形虫感染的ＤＣ２．４细胞没逡逑有出现很大的形态学变化。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｔｈｅ邋ｉｎｖａｓｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＤＣ２．４邋ｂｙ邋Ｔ．邋ｇｏｎｄｉｉ邋ＲＨ邋ｗａｓ邋ｅｖａｌｕａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＲＨ－ＧＦＰ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．逡逑（ＭＯＩ＝３邋Ｘ４０）逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R382.5

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