使用原子力显微镜观察细胞表面成孔的初步探讨
发布时间：2020-05-25 04:16
【摘要】：在细胞膜上形成不同类型的孔,可导致不同类型的细胞死亡,其深刻地影响细胞的命运和疾病状态。细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞可通过分泌穿孔素在细胞膜上成孔来介导病毒感染的细胞或肿瘤细胞死亡。脂多糖等细菌毒素可诱导GSDMD发生剪切,在细胞膜上成孔来诱导细胞发生焦亡。发生焦亡的细胞会释放大量炎性内容物,引起炎症级联反应,过度的细胞焦亡可导致各种免疫性疾病甚至发生感染性休克。然而,迄今为止,这些细胞膜上的孔的结构和形态从未真正被观察到。最近研究表明,原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)是分析生物分子和细胞结构性质的有力工具。AFM可达到原子分辨率的水平来观察生物样品的表面粗糙度。因此我们使用AFM来清晰地显示不同原因造成的细胞膜孔结构。我们使用293T细胞进行真核重组表达人PFR,并将其用于处理OVA-B16黑色素肿瘤细胞。处理15分钟后,为了方便观察,使用4%多聚甲醛固定细胞,并通过AFM扫描成像进行观察,在OVA-B16黑色素肿瘤细胞膜表面发现了形成的孔洞。应用细菌来源的一种毒素,链球菌溶血素O来处理OVA-B16黑色素肿瘤细胞也发现了清晰的孔洞,但AFM成像显示PFR在细胞膜上成孔的直径明显比链球菌溶血素O大。此外我们使用AFM成像发现,细胞膜表面的孔洞形成具有时间依赖性,细胞膜表面随着处理时间的延长,孔洞的数量直径也在相应增加。使用AFM进一步观察到细胞通过某种方式自我修复了由链球菌溶血素O在细胞膜上形成的孔洞。人胚肾细胞293T细胞系中和人乳腺癌MC7-F细胞系中过表达焦亡的执行分子GSDMD,通过AFM观察发现细胞膜上均有孔洞的形成。有研究表明补体通过在细胞膜上成孔来杀灭病原菌,在本研究中,AFM成像为补体介导的细胞膜表面成孔提供了有力的可视化证据。AFM这种可视化不仅清晰的显示了不同因素形成的细胞膜孔洞的孔径和深度的区别,而且发现了细胞膜孔洞的形成具有时间依赖性。AFM这种类型的可视化生动地揭示了细胞膜孔形成,融合和修复的动态过程,为之后对细胞成孔的研究提供了有力的支持。
【图文】：
图１使用ＡＦＭ观察ＳＬＯ邋／ＰＦＲ诱导的孔形成。（ａ）分别用ＰＢＳ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６细胞系１５ｍｉｎ，然后用ＰＢＳ洗涤细胞两次之后在原子力显微镜下成像观察。ｂ－ｇ首先分别用分离自活化的人ＣＤｒＴ细胞的ＳＬＯ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６细胞系（１Ｘ１０５）邋５分钟，并用４％多聚甲醛固定，用ＡＦＭ成像。（胞系被固定后，在ＡＦＭ下成像。（ｃ）细胞膜的３Ｄ拓扑图（ｄ）基于高分辨率
我们研究了邋ＳＬＯ诱导孔洞形成的动态过程。用浓度５０Ｕ的ＳＬＯ处理逡逑ＯＶＡ－Ｂ１６黑色素肿瘤细胞１０分钟或３０分钟时，孔洞开始形成，并且孔洞的数目逡逑X椉樱ㄍ迹玻幔孀糯硎奔涞难映ぃ赴け砻嬉苍嚼丛酱植冢ㄍ迹玻猓獗礤义厦骺锥吹男纬晒淌蔷哂惺奔湟览敌浴４送猓遥幔遥窈停遥恚幔闹迪嘤Φ卦黾樱ㄍ煎义希玻悖４硎奔涞难映げ唤鍪瓜赴ど峡锥吹氖吭黾樱赴ど匣钩鱿至撕芏嘀卞义暇督洗蟮目锥矗ㄍ迹玻洌澹Ｐ纬山洗蟮目锥纯赡芄橐蛴谛】椎娜诤希⑶遥樱蹋峡赡苁瑰义嫌媚持趾愣Ｊ皆谙赴ぶ谐中纬煽住Ｎ颐怯茫担埃斟澹樱蹋洗恚希郑粒拢保逗谏刂族义狭鱿赴氖奔涠文冢⒔校杉尤肷锨逡褐校ü校山胂赴娜旧恳越徊藉义现な悼锥葱纬墒且桓鍪奔湟览敌怨獭Ｎ颐堑难芯拷峁⑾郑校墒贾找允奔湟览档腻义戏绞浇耄希郑粒拢保逗谏刂琢鱿赴＃樱蹋霞尤耄捶种又螅校煽梢越胂赴绣义先旧＃樱蹋霞尤耄保胺种又螅灾黾恿讼赴校校扇旧那慷龋す夤簿劢瓜晕㈠义暇档慕峁土魇较赴堑慕峁捕贾っ髁烁媒峁ㄍ迹玻
本文编号：2679555
【图文】：
图１使用ＡＦＭ观察ＳＬＯ邋／ＰＦＲ诱导的孔形成。（ａ）分别用ＰＢＳ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６细胞系１５ｍｉｎ，然后用ＰＢＳ洗涤细胞两次之后在原子力显微镜下成像观察。ｂ－ｇ首先分别用分离自活化的人ＣＤｒＴ细胞的ＳＬＯ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６细胞系（１Ｘ１０５）邋５分钟，并用４％多聚甲醛固定，用ＡＦＭ成像。（胞系被固定后，在ＡＦＭ下成像。（ｃ）细胞膜的３Ｄ拓扑图（ｄ）基于高分辨率
我们研究了邋ＳＬＯ诱导孔洞形成的动态过程。用浓度５０Ｕ的ＳＬＯ处理逡逑ＯＶＡ－Ｂ１６黑色素肿瘤细胞１０分钟或３０分钟时，孔洞开始形成，并且孔洞的数目逡逑X椉樱ㄍ迹玻幔孀糯硎奔涞难映ぃ赴け砻嬉苍嚼丛酱植冢ㄍ迹玻猓獗礤义厦骺锥吹男纬晒淌蔷哂惺奔湟览敌浴４送猓遥幔遥窈停遥恚幔闹迪嘤Φ卦黾樱ㄍ煎义希玻悖４硎奔涞难映げ唤鍪瓜赴ど峡锥吹氖吭黾樱赴ど匣钩鱿至撕芏嘀卞义暇督洗蟮目锥矗ㄍ迹玻洌澹Ｐ纬山洗蟮目锥纯赡芄橐蛴谛】椎娜诤希⑶遥樱蹋峡赡苁瑰义嫌媚持趾愣Ｊ皆谙赴ぶ谐中纬煽住Ｎ颐怯茫担埃斟澹樱蹋洗恚希郑粒拢保逗谏刂族义狭鱿赴氖奔涠文冢⒔校杉尤肷锨逡褐校ü校山胂赴娜旧恳越徊藉义现な悼锥葱纬墒且桓鍪奔湟览敌怨獭Ｎ颐堑难芯拷峁⑾郑校墒贾找允奔湟览档腻义戏绞浇耄希郑粒拢保逗谏刂琢鱿赴＃樱蹋霞尤耄捶种又螅校煽梢越胂赴绣义先旧＃樱蹋霞尤耄保胺种又螅灾黾恿讼赴校校扇旧那慷龋す夤簿劢瓜晕㈠义暇档慕峁土魇较赴堑慕峁捕贾っ髁烁媒峁ㄍ迹玻
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