恶性疟原虫中ATG4蛋白定位的研究

发布时间：2020-05-31 07:47

【摘要】：目的:疟疾是一类由按蚊作为传播媒介的传染性疾病。据报道2017年全球约有21900万人感染疟疾,约435000人死于疟疾。恶性疟原虫是WHO非洲区域最流行的疟疾寄生虫,占2017年疟疾病例的99.7%。然而,恶性疟原虫对所有的抗疟药均产生了不同程度的抗药性。RTS,S疫苗作为目前最先进的疟疾候选抗原,最近出现总体效率低的问题。因此,研制一种新型有效的抗疟药是消除恶性疟原虫的有力手段。近年来,ATG(autophagy-related proteins,ATG)作为自噬相关蛋白被认为是开发抗疟新药有希望的作用靶点,而ATG4(autophagy-related protein 4,ATG4)作为抗疟靶点的研究尚无报道。自噬作用广泛存在于大部分真核细胞中,是细胞降解胞内蛋白及细胞器,保持内环境稳定的一种重要方式。同时也是溶酶体对自身结构的吞噬降解,是细胞内的再循环系统,有30多种不同类型的自噬相关蛋白(ATG)参与了这一过程。由于自噬对细胞内的降解和生物合成过程具有重要作用,所以猜测在疟原虫的发育过程中它可能也发挥关键作用。ATG蛋白在包括酵母、植物和哺乳动物在内的真核生物中高度保守,然而在原生生物中仅部分保守。新的实验证据表明自噬在恶性疟原虫或弓形虫等致病性寄生虫的分化、发育和存活中的重要性。ATG8(autophagy-related protein 8,ATG8)是许多有机体中应用最广泛的自噬体标记蛋白且被认为是寄生虫存活必不可少的,并在发育的各阶段均有表达。ATG4和ATG8同属于ATG8缀合系统,且ATG4对ATG8具有重要作用。因此,本研究拟在对ATG4蛋白生物信息学分析的基础上,明确自噬相关蛋白ATG4在恶性疟原虫中的定位,从而为下一步ATG4在恶性疟原虫中相关功能的研究和抗疟新药的研发提供一定的理论基础。研究方法:通过生物信息学分析Pf ATG4(PlasmoDB ID:PF3D7_1417300)蛋白包括结构域,信号肽,跨膜区,进化树及同源性等基础信息;运用载体构建在原核表达系统中获得PfATG4重组蛋白;通过免疫小鼠以获得PfATG4重组蛋白的抗血清;通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PfATG4重组蛋白的免疫原性;取不同培养时期的3D7虫血涂片,经吉姆萨染色处理后,在电子显微镜下观察3D7各期形态;利用间接免疫荧光实验(IFA)和免疫印迹实验(western blot)定位PfATG4蛋白的表达阶段。结果:1.生物信息学分析表明Pf ATG4是一个无信号肽、无跨膜区的蛋白;含有low complexity region、2个中央重复区和2个Pfam结构域。根据进化树和同源比对发现ATG4在各种疟原虫中相对保守,在酵母中仅部分保守。2.通过载体构建得到纯化后的PfATG4重组蛋白。3.成功获得了PfATG4抗血清。4.与对照组相比,PfATG4重组蛋白的免疫血清水平有明显升高;5.IFA及Western blot检测发现PfATG4在环状体、滋养体和裂殖体三个不同时期均有表达。结论:1.Pf ATG4重组蛋白具有良好的免疫原性。2.PfATG4表达在无性阶段的环状体、滋养体和裂殖体期。3.PfATG4为胞浆表达蛋白。
【图文】：

3 结果.1 生物信息学分析经生物信息学分析，恶性疟原虫 ATG4(ID: PF3D7_1417300)位于疟原虫第 14染色体 709670-713309 之间。全长包含 1124 个氨基酸，基因组 DNA 为 3640 bp。文选取 PfATG4 蛋白的 620-772aa（amino acid, aa）作为研究对象。利用 SMART件对 PfATG4 蛋白结构域预测，结果显示 PfATG4 包含 low complexity region、2中央重复区和 2 个 Pfam 结构域（图 1）；运用 Signalp 4.1server 预测信号肽，发现fATG4 不存在信号肽（图 2）；TMHMM2.0 软件对跨膜区预测发现 PfATG4 无跨膜域（图 3），预测 PfATG4 可能为胞浆表达。进化树结果显示 ATG4 在各种疟原虫属中亲缘关系较近（图 4），同源序列比对可见 ATG4 蛋白在各种疟原虫中相对保，在酵母中仅部分保守（图 5）。

PfATG4 蛋白的 620-772aa（amino acid, aa）作为研究对象。利用PfATG4 蛋白结构域预测，结果显示 PfATG4 包含 low complexity r复区和 2 个 Pfam 结构域（图 1）；运用 Signalp 4.1server 预测信号 不存在信号肽（图 2）；TMHMM2.0 软件对跨膜区预测发现 PfATG 3），预测 PfATG4 可能为胞浆表达。进化树结果显示 ATG4 在各种缘关系较近（图 4），，同源序列比对可见 ATG4 蛋白在各种疟原虫中母中仅部分保守（图 5）。图 1. PfATG4 蛋白结构域示意图包含 1124 个氨基酸。其中红色代表中央重复区，分别为 348-407aa，595-65m 区：即 Peptidase_C54 结构域，分别为 144-643aa，759-1088aa；灰色代表低
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R382.31

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本文编号：2689531