基因工程黏膜佐剂CTA1-DD的制备及其免疫效果的研究

发布时间：2020-05-31 10:18

【摘要】：接种疫苗是预防与控制病原体传染最有效的方式。目前,尽管有些病原体进入机体是通过黏膜系统进入机体,但是绝大多数疫苗免疫方式为注射免疫。虽然该类免疫方式可以为机体提供一定保护效果,但是因其主要诱导机体中IgG抗体产生而不能有效刺激机体产生黏膜免疫反应,具有一定的局限性。而黏膜免疫不仅可以刺激机体产生有效的黏膜免疫应答,诱导局部IgA抗体分泌,防止病原体通过黏膜感染或者入侵机体,还可以促进机体产生细胞介导免疫应答以及体液免疫应答。另外,与传统注射免疫相比,黏膜免疫方式具有更易被接种者接受、简化接种程序、降低疫苗成本以及可以避免经血液传播传染性疾病的交叉感染等优势。虽然黏膜免疫方式具有如此多的优点,但是因其需要较大量的抗原以及抗原经黏膜进入机体需克服黏膜耐受等问题只有少数的黏膜免疫疫苗应用于人类。佐剂因其对于增强免疫过程中免疫反应至关重要而在疫苗研究中备受关注。然而,目前只有少数安全有效的疫苗佐剂应用于人类疫苗,尤其是黏膜佐剂。因此,研制出一种有效、安全的黏膜免疫佐剂对于黏膜免疫疫苗的发展具有极为重要的意义。本研究在霍乱毒素A1亚基的基础上,在其C末端连接金黄色葡萄球菌A蛋白人工类似物的二聚体(DD),后者是一种免疫球蛋白(Ig)结合片段,可将A1亚基靶向至B细胞受体以及免疫球蛋白,构建融合蛋白CTA1-DD并对其作为黏膜佐剂效果评价研究。流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸系统疾病,常常伴随高烧、流鼻涕以及全身肌肉酸痛等症状,经常造成流感爆发大流行以及季节性流感。据统计每年在季节性流行期间,全世界约10%-20%的人口会感染流感病毒,导致300万-500万严重病例以及29万-65万人死亡。流感病毒可以分为甲型流感病毒(A)、乙型流感病毒(B)、丙型流感病毒(C)以及丁型流感病毒(D)四类。除丁型流感病毒外都可感染人类引起流感,其中甲型流感病毒中的H1N1、H3N2以及H5N1等是引起流感大流行的主要病原体,因此对于该类病毒的预防与控制对人类公共卫生事业具有极其重要的意义。甲型流感病毒是正粘病毒科流感病毒属中单股负链RNA病毒,该病毒在传播过程中常发生抗原转变进而引起新型流感爆发。虽然该病毒经过呼吸道黏膜入侵机体,但是目前所有的灭活、裂解以及亚单位疫苗都是通过皮下或肌肉注射免疫的途径接种。因此研究一种安全有效的黏膜免疫流感疫苗具有非常重要的意义。为此,本论文选用无毒的CTA1-DD作为黏膜佐剂并分别应用于甲型流感病毒H1N1裂解疫苗以及H3N2裂解疫苗经鼻腔免疫小鼠后对其效果进行评价,本研究为CTA1-DD作为人类疫苗的新型黏膜佐剂奠定基础。本研究首先利用原核表达系统表达新型黏膜佐剂CTA1-DD蛋白,利用密码子优化、基因合成、酶切连接等技术将目的基因插入表达载体pET30a,成功构建重组表达质粒pET30a-CTA1-DD,然后将其转入BL21(DE3)中表达。结果表明该蛋白即可可溶性表达又可以包涵体形式表达,表达蛋白分子量约为36KD。为便于后期实验利用,选用可溶性表达蛋白进行纯化。该蛋白经阴离子交换、分子筛层析技术获得纯度高达98.43%、浓度2.4mg/ml的CTA1-DD蛋白。另外,将CTA1-DD佐剂蛋白分别与H1N1裂解亚单位成分以及H3N2裂解亚单位成分混合经鼻腔免疫后观察其免疫效果,并与常规氢氧化铝佐剂联合裂解亚单位成分经肌肉注射免疫效果比较。动物实验结果表明,与氢氧化铝佐剂组相比,当CTA1-DD与甲型流感裂解亚单位成分混合滴鼻免疫小鼠后可以显著增强血清中特异性IgG抗体水平,同时促进小鼠呼吸道以及阴道等黏膜处IgA的分泌与产生,这一结果提示CTA1-DD作为流感裂解疫苗的黏膜佐剂经过鼻腔免疫不仅可以刺激机体产生有效的体液免疫应答,还可以刺激机体产生黏膜免疫应答;在氢氧化铝佐剂联合裂解亚单位成分肌肉注射后,血清中存在较高水平的IgG抗体,但在呼吸道以及阴道处未检测到IgA抗体,提示了常规免疫方式可以有效激活体液免疫应答,而不能刺激机体产生黏膜免疫应答。此外,ELISPOT实验以及血清中IgG亚型抗体水平证明,CTA1-DD联合甲型流感裂解亚单位成分经滴鼻免疫可以促进分泌IFN-Υ的T淋巴细胞增殖以及降低IgG1/IgG2a 比值,这一结果揭示了 CTA1-DD可以有效激活体内Th-1类细胞反应;而氢氧化铝佐剂联合裂解亚单位成分经肌肉注射免疫可以促进分泌IL-4的T淋巴细胞增殖以及提高IgGl/IgG2a 比值,这一结果显示氢氧化铝佐剂通过激活体内Th-2类细胞反应发挥作用。同时,HI效价检测结果也证实CTA1-DD作为黏膜佐剂比氢氧化铝佐剂具有更好的效果,可以刺激小鼠体内产生更强的HI滴度。最后,为了评价CTA1-DD作为黏膜免疫佐剂的效果,对免疫后小鼠分别进行致死剂量的活毒攻击实验。两部分实验均发现CTA1-DD混合裂解亚单位成分滴鼻免疫后可以提供100%的保护效果,并且极大地降低了发病率;而铝佐剂混合H1N1裂解亚单位成分仅有66.67%的保护效果,混合H3N2裂解亚单位成分仅提供50%的保护效果,且两部分实验结果都发现铝佐剂组伴随着精神萎靡、毛发直立、食欲不振、消瘦以及行动迟缓等症状。综上所述,本研究利用原核表达系统,经阴离子交换、分子筛层析获得高纯度CTA11-DD佐剂蛋白。CTA1-DD具有良好的黏膜佐剂活性,对滴鼻免疫裂解疫苗具有较好的免疫应答辅助作用,不仅可以刺激机体产生系统免疫应答和黏膜局部免疫应答,还可以有效激活Th-1类细胞免疫应答。总之,该佐剂可以作为预防呼吸道疾病和其他经黏膜感染机体的病原体的黏膜佐剂进一步探索。
【图文】：

核苷酸序列,表达载体构建,表达载体,分子生物学技术

进其可溶性表达，我们按照大肠杆菌偏好密码子对目的基因的核苷酸序列优化后逡逑合成。然后再利用其他的分子生物学技术，将目的基因插入表达载体ＰＥＴ３０ａ，逡逑并将该表达载体命名为ＰＥＴ３０ａ－ＣＴＡｌ－ＤＤ，具体构建如下图１．１：逡逑１４逡逑

基因工程黏膜佐剂CTA1-DD的制备及其免疫效果的研究

ApET30a双醉切结果
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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