miR-959在果蝇Toll免疫响应中的作用机制研究

发布时间：2020-06-15 15:26

【摘要】：黑腹果蝇作为研究先天免疫机制的模式生物,在免疫学史上起到了里程碑式的重要作用。对于果蝇的先天性免疫研究科学家们已大致掌握了它的机理,果蝇的先天免疫包括体液免疫、细胞免疫以及黑化反应三方面,其中Toll免疫信号通路和Imd免疫信号通路是果蝇最重要的体液免疫方式。而Toll通路是果蝇中被广泛了解的重要通路之一。其作用机制是主要通过一系列信号传导、级联反应抵抗革兰氏阳性菌以及病原体的入侵。已有大量研究表明,microRNA(miRNA)在果蝇免疫信号传递过程中发挥着重要的调控作用。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的小非编码RNA,长度约为20个核苷酸,通过结合靶基因mRNA的特定靶位点发挥其调控转录后水平的基因表达的作用,进而调控生物体的各种生理活动。然而目前,虽然有关Toll信号通路的机制的研究报道已经十分透彻了,但对于果蝇Toll信号通路相关miRNA的研究却不够清晰。故本论文采用实验生物学和生物信息学有机结合的方法,针对miRNA能否调控果蝇Toll信号通路设计如下相关实验。通过体内、体外实验证明果蝇miR-959能够直接靶向tube基因来调控Toll信号通路。本论文所取得的主要实验研究结果如下;1.利用Tub-Gal80ts/+;Tub-Gal4系统果蝇与UAS-miR-959/960/961/962果蝇杂交,得到miR-959/960/961/962高表达的果蝇株,通过实时荧光定量(qRT-PCR)检测高表达果蝇在感染革兰氏阳性菌藤黄微球菌(M.luteus)后(0h、6h、12h、24h、48h和72h)抗菌肽的表达量,确认其免疫相关性。随后又检测分别高表达miR-959、miR-960、miR-961、miR-962果蝇在RNA水平抗菌肽Drs的表达量。结果显示miR-959在12h时Drs的表达量显著下降。并且对miR-959/960/961/962这一簇果蝇中的每个miRNA分别在其高表达果蝇中检测miRNA的表达量,再通过Western Blotting实验进一步验证,确定miR-959具有免疫相关性。2.采用革兰氏阳性菌刺激野生型果蝇,在RNA水平分时间点(0h、3h、6h、12h、24h、48h)检测果蝇体内的miR-959表达量,在6个时间点表达量都上调并在12h时miR-959的表达量显著升高,达到峰值,这表明miR-959被阳性菌刺激后在野生型果蝇中可能具有Toll信号通路的免疫相关性。3.为进一步研究miR-959影响果蝇Toll通路的作用机制,我们通过TargetScan和miRanda两种生物信息学预测软件预测了miR-959可能靶向的基因是tube。4.采用双荧光素酶报告系统在果蝇S2细胞内验证miR-959与靶基因tube的相互关系,直接证明tube是miR-959的靶基因。5.在果蝇体内利用qRT-PCR再次验证了miR-959和tube基因的靶标关系,进一步证实miR-959通过靶向tube抑制抗菌肽的表达。6.构建高表达miR-959与miR-959sponge杂交为一体的补偿型果蝇果蝇,再进一步地确定了miR-959在果蝇体内对Toll通路负调控作用。综上所述,我们通过对miR-959/960/961/962这一簇miRNA的免疫相关性的确定,发现这簇miRNA中只有miR-959可能负调控果蝇Toll免疫信号通路,并进一步探究了miR-959发挥这一功能的内在机制。最终发现miR-959通过结合靶基因tube的3’UTR,影响其正常表达,从而减少抗菌肽Drs的表达实现对Toll信号通路的负调控。本课题为探究miRNA在先天免疫中的功能资料库补充了相关研究参考。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

序列,机制,靶基因,转录后水平

图 1.1 miRNA 合成的机制[62]Figure 1.1 structure and biogenesis1.1.3 miRNA 的作用机制miRNA 在生物复杂性的进化中起着重要作用[16]，是转录后水平上基因表达的关键调控因子[15]。在了解 miRNA 生物学方面的进展以及越来越多的不同测序基因组的可用性之后，逐渐揭示了 miRNA 及其靶点的分子机制[17]。首先成熟的 miRNA 与相关蛋白形成 RISC 沉默复合体，通过识别特定的序列结合到靶基因的 3’UTR 的相关区域上，进而发挥其调控作用，通过抑制靶基因的转录后水平过程来抑制其表达。miRNA 与靶基因的结合作用分为完全碱基互补配对原则和不完全碱基互补配对原则，通过结合特定靶基因 3'UTR 的特殊区域，发挥抑制mRNA 转录后过程或直接降解 mRNA 的作用[18]。在一般情况下，在动物体内 miRNA与靶基因的靶位点两者通过不完全互补配对方式结合，对基因的翻译过程造成阻断，从而抑制基因表达[19]。另一种方式多数存在在植物体内，当 miRNA 与靶 RNA 完全互补配对时，引起目的 mRNA 的特异性断裂,从而导致基因沉默。miRNA 和目的基因

机制,调节发育,凋亡,兴奋传递

3图 1.2 miRNA 的作用机制Figure 1.2 Mechanism of action of miRNAiRNA 的功能编码小 RNA 在多种生物体内的基因表达调控中发挥着重要作用[24]。杆线虫中就被报道的 miRNA 用于调节发育时起，在各种各样的生物千种新的 miRNA，这些 miRNA 可能在每个生物或多数生理过程中。动物来说，miRNA 可以调节细胞分化、发育和凋亡，据已有研究表明参与调控动物生殖细胞的增殖与分化；miR-14 通过抑制凋亡蛋白的凋亡，对于胚胎的形成与发育有重要的生物学意义。此外，miRNA 调节作用，例如 miR-218 在海马发育过程中介导的兴奋传递调控和态调控中发挥关键作用。同样 miRNA 也参与植物体器官发育和环境

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