丹参酮ⅡA通过调节铁稳态抑制脑缺血模型中铁死亡的机制研究

发布时间：2020-07-03 13:46

【摘要】：背景:铁死亡(Ferroptosis)是铁离子依赖性的,非典型的细胞死亡形式,其特征在于脂质过氧化产物和活性氧的积累,近年来的机制研究发现,铁死亡与脑缺血的发生有关,然而,其发生铁死亡的机制尚不清楚,需要进一步研究。铁广泛存在于脑组织,是脑的重要成分,脑缺血时铁和铁代谢相关蛋白发生改变,导致脑组织铁含量升高及神经元铁沉积,引起神经元损伤过量自由基的产物通过侵袭脂类、DNA和蛋白质,导致细胞严重的氧化损伤和氧化应激。丹参酮ⅡA能在脑缺血模型中发挥神经保护作用,但是丹参酮ⅡA能否通过调节铁稳态而抑制脑缺血中铁死亡的发生尚需进一步研究。所以探讨脑缺血模型中丹参酮ⅡA抑制铁死亡发生的机制,可为脑缺血的临床治疗进一步提供实验依据和新思路。目的:探索丹参酮ⅡA在脑缺血模型中抑制铁死亡的机制。方法:首先进行小鼠海马细胞株的培养,使用铁死亡激活剂Erastin处理HT22细胞建立铁死亡损伤模型和利用缺氧装置构建OGD模型,然后构建大脑中动脉闭塞脑缺血的小鼠模型。通过CCK-8法和Hoechst染色检测细胞活力后确定最佳的造模浓度;倒置显微镜下观察细胞的形态变化;超氧化物阴离子荧光探针(DHE)、BODIPY?581/591 C11检测细胞内活性氧(ROS)及脂质过氧化(Lipid peroxidation)变化;FeRhoNox?-1探针检测细胞内活性铁含量;免疫荧光检测细胞内4-HNE表达;Western blot法检测COX-2、铁转运相关蛋白变化。体内模型将小鼠的大脑中动脉闭塞60分钟,然后再灌注。术后应用神经功能评分和平衡木实验检测小鼠神经功能和肢体活动;采用TTC染色法检测小鼠脑缺血体积;使用MDA试剂盒检测脑缺血脑组织中氧化产物的含量;Western blot法检测COX-2、铁转运相关蛋白变化。结果:1.CCK-8实验结果表明,0.5μmol/L Erastin作用HT22细胞8 h,细胞有50%的死亡,选择此剂量和时间造模;而加入0.1μmol/L Tan ⅡA对细胞具有明显的保护作用;OGD模型作用HT22细胞18 h再灌注10 h后细胞约有50%以上的死亡,选择此时间造模;而加入1μmol/L Tan ⅡA对细胞具有明显的保护作用;2.细胞形态学观察和Hoechst染色结果显示,当0.5μmol/L Erastin作用HT22细胞8 h后,细胞变小变圆,细胞的贴壁状态差,出现损伤状态,加入0.1μmol/L Tan ⅡA对细胞具有明显的保护作用;OGD模型作用于HT22细胞18 h再灌注10h后,对细胞损伤的影响,加入1μmol/L Tan ⅡA对细胞有明显的保护作用;3.DHE和BODIPY?581/591 C11荧光染色结果表明,与对照组相比,Erastin组和OGD组中细胞内ROS和lipid peroxidation显著增高,Tan ⅡA组中细胞内ROS和lipid peroxidation升高没有统计学意义;4.FeRhoNox?-1探针染色结果表明,与对照组相比Erastin组和OGD组中细胞内活性铁显著增高,Tan ⅡA组和对照组之间细胞内活性铁没有显著差异;5.免疫荧光检测4-HNE结果显示,与对照组相比,OGD组细胞内4-HNE表达显著增加,Tan ⅡA组和对照组之间细胞内4-HNE表达没有显著差异;6.TTC染色结果表明,与对照组相比MCAO组小鼠脑缺血体积增大,与MCAO组相比Tan ⅡA组中小鼠脑缺血体积减小;7.神经功能评分和平衡木实验结果表明,与MCAO组相比Tan ⅡA组中小鼠神经功能评分降低,而平衡木实验评分增高;8.MDA结果显示,与对照组相比,MCAO组小鼠脑组织脂质氧化产物含量增加,与MCAO组相比,Tan ⅡA组中小鼠脑组织脂质氧化产物含量降低;9.Western blot结果显示,与对照组相比,OGD组和MCAO组COX-2蛋白表达增多而铁转运相关蛋白降低,但是Tan ⅡA组COX-2蛋白表达降低而铁转运相关蛋白却增高。结论:丹参酮ⅡA对脑缺血模型中的铁死亡具有抑制作用,它的机制可能是通过调节铁稳态,减少细胞内的ROS、Lipid peroxidation、活性铁含量,从而发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743;R-332
【图文】：

n对HT22的细胞毒性 μmol/L Erastin处理组；C：0.5 μmol/L Erastin处理组；5，**P＜0.01，***P＜0.001，与对照组（0 μmol/L）比s the cytotoxicity of Erastin on HT2205 μmol/L Erastin treatment group; C: 0.5 μmol/L Erastin ent group; *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, compared wstin损伤HT22细胞存活率的影响不同浓度的Tan IIA对HT22细胞存活率的影响。明显的保护作用，与对照组相比，细胞存活率（表明Tan IIA在该浓度范围内显着抑制HT22细胞

对HT22的细胞毒性mol/L Tan IIA预处理后加入Erastin 0.5 μmol/L；C： μmol/L；D：1 μmol/L Tan IIA预处理后加入Erasti**P＜0.01he cytotoxicity of Tan IIA on HT22 μmol/L Tan IIA pre-treated with Erastin 0.5 μmol/L; Ctin 0.5 μmol/L; D: 1 μmol/L Tan IIA pre- After treatmpared with the control group (0 μmol/L): **P<0.01察和Hoechst染色确定Tan IIA对HT22细胞的观察细胞后，发现0.5 μmol/ L Erastin在HT22变化。折射率显着降低，很多细胞悬浮。与

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本文编号：2739737