甘胆酸的单克隆抗体制备及免疫分析方法研究

发布时间：2020-07-03 14:15

【摘要】：肝细胞受损并累积可引发肝脏疾病,肝细胞受损程度和肝功能的实时检测评价,对于预防、早期诊断和治疗肝脏疾病具有重要意义。甘胆酸是胆汁酸的主要成分之一,由胆固醇与肝内的甘氨酸结合而成,研究指出,甘胆酸经肾脏排泄明显,与肝胆疾病的严重程度相关,是评价肝脏功能的一项很重要的指标。因此,检测尿液中的甘胆酸对临床检测有一定指导价值,且临床上检测甘胆酸多为取静脉血,对于小儿患者和不便于取静脉血的患者,检测其尿液中的甘胆酸有着其便利性与对疾病诊断的研究意义。本研究首先通过细胞融合获得甘胆酸(GCA)的单克隆抗体,同时建立基于甘胆酸单克隆抗体的表面等离子共振生物传感器、免疫层析试纸条和化学发光免疫分析方法。具体的实验内容包括以下几个方面:1、甘胆酸单克隆抗体的制备及表征本实验采用活泼脂法合成的免疫抗原GCA-BSA并免疫雌性Balb/C小鼠,经过细胞融合,获得能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株GCA-BSA-5H2。采用腹水诱生法获得大量单克隆抗体,先通过辛酸-硫酸铵法初步纯化,再通过Protein G柱纯化和单克隆抗体亚型分型试剂盒鉴定其亚型为IgG1型。2、建立基于甘胆酸单克隆抗体的表面等离子共振生物传感器本实验将不同稀释度的甘胆酸单克隆抗体注入富集有包被抗原GCA-OVA的CM5芯片,测得单克隆抗体与甘胆酸之间的亲和力为Kd=1.983*10-9M。建立基于甘胆酸单克隆抗体的表面等离子共振生物传感器的标准抑制曲线。IC50为39.8ng/mL,线性范围是13.3-119.4ng/mL。除了与牛黄胆酸(TCA)的交叉反应率达40%,其他的胆酸结构类似物与对应抗体的交叉反应率均小于10%。为了验证基于单克隆抗体的表面等离子共振生物传感器,利用间接竞争ELISA与其进行比较,两者具有很强的相关性(R2=0.9983)。3、建立基于甘胆酸单克隆抗体的免疫层析试纸条本实验制备了平均粒径约为115.45±10.53nm聚苯胺-金纳米粒子,以聚苯胺-金纳米粒子为标记物制备了聚苯胺-金纳米试免疫层析纸条,对基于甘胆酸单克隆抗体的免疫层析试纸条进行方法学考察,研究结果表明,该试纸条特异性好,重复性高,性能稳定,可将其应用于尿液样品中甘胆酸的定性检测。4、基于甘胆酸单克隆抗体的化学发光免疫分析方法将聚苯胺-金纳米粒子(PPAuNP)标记IgG-HRP,确定CLIA方法的最优工作条件为包被时间为1.5h,封闭为0.75h,抗原抗体反应时间为0.75h,标记的IgG-HRP与抗体反应时间为0.75h,发光底物作用时间为4min。利用GCA建立标准曲线,所建立方法的检测范围(IC15-IC85)为 161.99-61929.99 ng/mL,IC5G值为 274.82,最低检测限(LOD,IC10)为56.26 ng/mL。并对334份人体尿液样本进行检测,慢性肝炎,肝硬化和肝肿瘤组尿液样品中的GCA浓度分别是健康对照组的6.3倍,9.1倍和10.1倍(P0.001),阳性率分别为86.4%、78.9%、63.7%。综上所述,本研究制备获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株GCA-BSA-5H2。以甘胆酸的单克隆抗体为基础分别建立了表面等离子共振生物传感器、免疫层析分析方法和化学发光免疫分析方法。通过对尿液中甘胆酸的定性检查,可在在早期筛查中快速判断病变标志物(甘胆酸)是否异常,而甘胆酸的定量检测结果表明,甘胆酸在不同肝脏疾病中的含量存在明显的差异,说明甘胆酸水平的高低与肝脏病理损害程度密切相关。通过与临床指标AST、ALT、AFP相比较,甘胆酸在能够更好的反映潜在的慢性肝损伤,在判断肝硬化与肝肿瘤方面优于AST、ALT、AFP指标。本实验中所研究的免疫学分析方法都可以对甘胆酸进行有效的检测,可实现对肝功能的监控。
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392-33;O657.3;TQ464
【图文】：

甘胆酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＡ）化学式为Ｃ２６Ｈ？Ｎ0６，分子量为：４６５．６２，微溶逡逑于水，无气味，为白色结晶粉末，熔点为１２８°Ｃ。其中文别名为Ｎ－（３，７，１２－三羟基－２４－逡逑羰基胆烷－２４－基）－甘氨酸。它的分子结构式如图１－１所示。逡逑？Ｈ六逡逑Ｖ逡逑十0丫ＮＨ逡逑ＨＯ、、、０Ｈ逡逑Ｈ逡逑图１－１甘胆酸的化学结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２甘胆酸的临床意义逡逑在肝细胞中，甘胆酸是由甘氨酸和胆酸所形成的结合胆汁酸，甘胆酸为胆酸的主逡逑要成分之一，甘胆酸以蛋白结合的形成存在于血清中［Ｍ１。在正常情况下，甘胆酸由肝逡逑细胞合成分泌而成，经过毛细胆管、胆管排入胆襄，再通过胆汁回流到十二指肠中，逡逑协助食物的消化。最后，９５％的甘胆酸会回到肠末端被重新吸收，经门静脉回到肝脏，逡逑此过程被称为肠－肝循环（图１－２）逦由此可知，若门静脉重吸收的甘胆酸可以被肝逡逑脏高效的回收，则再次进入体循环的甘胆酸不达总量的百分之一，故而血液中甘胆酸逡逑的含量较低，可当肝脏受到损伤之后，经门静脉重吸收的甘胆酸则不能有效的被肝细逡逑胞所吸收

甘胆酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＡ）化学式为Ｃ２６Ｈ？Ｎ0６，分子量为：４６５．６２，微溶逡逑于水，无气味，为白色结晶粉末，熔点为１２８°Ｃ。其中文别名为Ｎ－（３，７，１２－三羟基－２４－逡逑羰基胆烷－２４－基）－甘氨酸。它的分子结构式如图１－１所示。逡逑？Ｈ六逡逑Ｖ逡逑十0丫ＮＨ逡逑ＨＯ、、、０Ｈ逡逑Ｈ逡逑图１－１甘胆酸的化学结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２甘胆酸的临床意义逡逑在肝细胞中，甘胆酸是由甘氨酸和胆酸所形成的结合胆汁酸，甘胆酸为胆酸的主逡逑要成分之一，甘胆酸以蛋白结合的形成存在于血清中［Ｍ１。在正常情况下，甘胆酸由肝逡逑细胞合成分泌而成，经过毛细胆管、胆管排入胆襄，再通过胆汁回流到十二指肠中，逡逑协助食物的消化。最后，９５％的甘胆酸会回到肠末端被重新吸收，经门静脉回到肝脏，逡逑此过程被称为肠－肝循环（图１－２）逦由此可知，若门静脉重吸收的甘胆酸可以被肝逡逑脏高效的回收，则再次进入体循环的甘胆酸不达总量的百分之一，故而血液中甘胆酸逡逑的含量较低，可当肝脏受到损伤之后，经门静脉重吸收的甘胆酸则不能有效的被肝细逡逑胞所吸收

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本文编号：2739772