Nrf2参与内皮祖细胞功能调控在血管老化中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-14 22:49

【摘要】：目的:衰老和糖尿病常伴随氧化应激的增加,通常与心血管疾病有关。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量减少和功能降低在内皮修复和心血管疾病发展中起关键作用。Nrf2调节氧化还原状态,在氧化应激中起重要保护作用。本研究的目的是探讨Nrf2对糖尿病及衰老进程中EPCs功能障碍的作用及潜在机制。方法:(1)通过饲养建立自然衰老小鼠模型。检测年轻(3~4个月),中年(12~13个月)和老年小鼠(22~24个月)EPCs的生物学功能。体外实验包括检测EPCs的迁移,增殖,成管和分泌(VEGF,SDF-1)功能。在体手术制备小鼠下肢缺血模型,使用激光多普勒灌注检测术后血流灌注恢复情况。测量缺血性腓肠肌中毛细血管密度。通过检测细胞内活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)评估前述EPCs中的氧化应激水平。此外,通过si RNA进行沉默年轻组小鼠EPCs中Nrf2表达和使用t BHQ活化老年组小鼠EPCs中Nrf2后再次评估EPCs的功能和氧化应激水平。Western Blot用于检测Nrf2,keap1,NLRP3,TRX1,TXNIP,p65的蛋白质表达水平。RT-PCR用于测定Nrf2,HO-1,NOQ-1,TRX-1,keap1,NLRP3,TXNIP,p65的m RNA表达。使用免疫荧光检测细胞及腓肠肌中Nrf2表达。(2)使用链球菌素造糖尿病小鼠模型。检测糖尿病小鼠中EPCs的生物学功能,包括迁移,增殖,成管和血管内皮生长因子(VEGF),基质衍生生长因子(SDF)和一氧化氮(NO)的分泌功能。检测细胞内活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)以评估糖尿病小鼠EPCs的氧化应激水平。检测p16,β-gal和SASP来评估EPCs的衰老。此外,使用si RNA技术沉默正常组Nrf2表达或通过t BHQ活化糖尿病小鼠Nrf2后评估EPCs的功能和氧化应激水平。结果:(1)体外和体内EPCs的生物学功能在衰老过程中降低,伴随着Nrf2表达及其靶基因(HO-1,NQO-1,TRX-1)的下降以及通过增加ROS增加的NLRP3表达和氧化应激水平。和MDA含量和降低SOD活性。此外,Nrf2沉默明显损害了EPCs的生物学功能,并增强了幼鼠EPCs的氧化应激。而Nrf2激活通过下调NLRP3炎性体来保护老年小鼠的受损EPCs免受氧化应激,并改善来自老年小鼠的EPCs的生物功能障碍。(2)糖尿病EPCs的生物学功能下降,伴随着Nrf2表达下降,细胞衰老加速,氧化应激水平升高,ROS和MDA含量增加,SOD活性降低。此外,Nrf2沉默明显损害了正常EPCs的迁移,增殖和分泌,增强了氧化应激和细胞衰老,而Nrf2激活保护了糖尿病EPCs免受氧化应激和细胞衰老,改善了糖尿病小鼠EPCs的生物学功能障碍。结论:老年和糖尿病小鼠EPCs生物学功能下降,氧化应激水平较对照组增加。Nrf2可改善氧化应激水平进一步保护老年和糖尿病小鼠EPCs生物学功能。Nrf2通过NF-κB信号通路下调NLRP3炎症小体,可以保护衰老进程中EPCs的功能损害。Nrf2通过调节细胞衰老来保护糖尿病小鼠中EPCs的功能性损伤。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1;R592;R-332
【图文】：

26图 2 EPCs 中 Nrf2 表达随着年龄的增长而减少。（A）低放大倍数图像显示 Nrf2 不同年龄组 EPCs 上的表达。（B）为 A 图的统计结果。（C）高放大倍数共聚焦图像示 Nrf2 在不同年龄组 EPCs 上的表达[细胞质中的 Nrf2 表达（白色箭头）和/或较轻细胞中的细胞核（红色箭头），MA 和 O 细胞中的 Nrf2 表达低或无（黄色箭头）]。P <0.05。N = 5。 Y，年轻组; M，中年组; A，老年组。 比例尺：A，100μm; C20μm。

当老年 EPCs 中 Nrf2 上调时（图 4G），它们的迁移（图 4H 和 I），增殖（图4J）和血管生成（图 4K）分泌（图 4L）显着改进，使它们类似于 年轻 细胞。这些数据表明，改变内在的 Nrf2 表达足以显着改变 EPCs 的存活和功能，支持该转录因子在衰老过程中对 EPCs 功能的重要调节作用。这些数据证实了通过调节来源于年轻和年老EPCs的Nrf2的表达可以改变其生物学功能，证实了 Nrf2 对 EPCs 生物学功能的重要

Transwell实验图示

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本文编号：2755603