人嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体分离鉴定及蛋白质组学研究

发布时间：2020-08-07 14:48

【摘要】：人嗅黏膜间充质干细胞(Human Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells,OM-MSCs)是一种可进行临床治疗的理想种子细胞。OM-MSCs的旁分泌作用被解释为其发挥组织及神经修复功能的主要机制,外泌体做为OM-MSCs旁分泌的一种重要的胞外囊泡,对其生物特性进行研究,有着十分重要的临床价值。外泌体是一种纳米级的膜性小泡,其中运载着来源于母细胞的各种蛋白质。尽管外泌体包含的核酸、脂质等功能分子研究火热,但蛋白质作为生命功能最直接高效的体现,其在由外泌体介导的信息传递和信号调控中发挥的作用同样不容忽视。因此,本研究首先采用组织贴壁法从人嗅黏膜组织中分离培养了OM-MSCs,采用经典的超速离心法分离纯化了OM-MSCs培养上清中的外泌体,并对分离得到的外泌体的表面标志物、粒子浓度、粒径分布和形态学特征进行了分析表征。结果表明,分离得到的OM-MSCs外泌体符合一般外泌体的特征,纯度较高且适用于进一步的蛋白质组学分析。为了探究OM-MSCs来源外泌体的蛋白质组成及潜在功能,本研究通过LC-MS/MS质谱对其进行了蛋白质组学分析,并对关键蛋白进行了相关的功能验证。通过质谱分析,共鉴定到304个OM-MSCs来源外泌体的蛋白质,这些蛋白质的亚细胞定位主要为囊泡和外泌体,占总蛋白数的80.4%,其主要作用于细胞膜上结合受体,并能够参与正调节生物进程和系统发育进程。在构建的候选蛋白质互作网络中,筛选到了大量与细胞增殖、凋亡、血管生成、神经营养和免疫调节相关的潜在候选蛋白,通过比对OM-MSCs的分泌组数据,从蛋白质组学的角度,揭示了OM-MCSs来源外泌体在基于OM-MSCs旁分泌治疗机制中的核心作用。这些候选蛋白质多参与了组织创伤修复相关的信号通路,而组织创伤修复的主要生理现象是伴随着内皮细胞增殖迁移导致的血管生成。相关的功能实验表明,OM-MSCs来源外泌体能被人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cells,HBMECs)摄取,并促进了HBMECs的增殖迁移和体外的血管形成。结合蛋白质组数据进行机制分析,其可能主要是通过OM-MSCs外泌体中的HSP90,EGFR,PDGFRB等分子,磷酸化了关键蛋白激酶AKT,活化PI3K/AKT信号通路导致的,这暗示了OM-MSCs来源外泌体有着治疗脑卒中导致的缺血性脑损伤的潜力。本研究实验数据,也为基于OM-MSCs移植的临床治疗,提供了重要的参考依据。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

化成细胞悬液，每管均分 100μL。实验管中分别加入鼠抗人抗体 CD34- ECD、CD45- PC7、CD90 - FITC、CD34- ECD、CD73- FITC，阴性对照管加入抗IgG-FITC、IgG- PE 室温孵育 30 min 后，进行流式细胞仪计数。2.3.3 外泌体的分离纯化本实验选择了经典的差速超速离心法提取 OM-MSCs 培养上清中的外泌体，这种方法被广泛的用于外泌体的分离纯化及下游的蛋白质组学分析，具体流程及步骤如图所示（图 2-1）。将含 100% 胎牛血清离心过夜后，收集上清使用 0.22μm针式滤头除菌，制备成无外泌体血清。稀释成 10% FBS 的 D/F-12 高糖培养基对分离纯化的 OM-MSCs 进行培养，培养 48 小时后收集上清，按照图中步骤进行外泌体离心分离，所有离心温度均设置为 4℃。最后收集的沉淀用 1×PBS 重悬，按说明书使用 BCA 试剂盒进行定量，分装后直接进行下游分析或-80℃保存备用。

做好标记。用加样枪，滴 10 μL 样本悬液于带膜铜网上，室温或37 度烤箱静置 1-5 分钟（依据样本浓度确定）。然后用剪成尖角的滤纸吸去多余液体，用加样枪滴 10 μL 磷钨酸染色液在制好样品的铜网上，1-2 分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液，再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，洗去多余的磷钨酸。然后静置干燥，使用电镜透射观察。2.4 结果与讨论2.4.1 OM-MSCs 的形态观察OM-MSCs 按贴壁法纯化培养后，8-9 天后有呈梭状和多角形状的细胞从组织块中延伸而出（图 2-2A）。培养至 12-14 天，细胞出现 80%~90%的融合，无明显接触抑制，可继续传代。传代后，细胞增殖速度明显加快，形态上更为趋同，均为成纤维细胞样紧密排列，且生长旺盛，与一般的 MSCs 形态一致（图 2-2B）。

人嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体分离鉴定及蛋白质组学研究2.4.2 OM-MSCs 的细胞表面标志物分析本实验采用流式细胞术，检测分离得到的细胞是否为符合相关标准的间充质干细胞。如图 2-3 所示，实验分离的 OM-MSCs 不表达造血系干细胞表面蛋白标志物 CD34 和 CD45，表达基质细胞和黏附相关蛋白标志物 CD73、CD90，符合间充质干细胞的表面标志物特性，证明从嗅黏膜中分离的成纤维样细胞的为间充质干细胞。

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