乙型脑炎病毒的分离鉴定及其在microRNA水平上与PK-15细胞的相互作用研究

发布时间：2017-03-31 07:18

  本文关键词：乙型脑炎病毒的分离鉴定及其在microRNA水平上与PK-15细胞的相互作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种危害严重的人畜共患病病原,属于黄病毒科黄病毒属。该病毒严重威胁人类健康,感染人后入侵中枢神经系统,造成死亡或者留下严重的神经系统后遗症。同时它可以感染猪群,造成种猪繁殖障碍,严重制约养猪业的发展,也造成巨大的经济损失。microRNA (miRNA)作为一种在转录后水平发挥基因调控功能的非编码小分子RNA,在细胞生长、分化、凋亡和代谢等生命过程中发挥着不可替代的作用,并且在病毒感染入侵及宿主细胞的抗病毒方面起着重要的调节作用。而目前对于JEV在miRNA水平上与PK-15细胞相互作用的研究暂无报道,相关研究对于深入了解JEV的致病机制及JEV的防控十分重要。本研究具体内容如下：通过观察细胞病变(CPE)情况及PCR检测,利用BHK-21细胞从四川流产死猪胎样品中成功分离出3株JEV,分别命名为JEV-SC-1株、JEV-SC-2株与JEV-SC-3株,基因分型研究显示3株病毒株均为基因Ⅲ型,其TCID50分别为10-5.81/0.025ml、10-5.12/0.025ml及10-4·42/0.025m1。选取JEV-SC-1株为代表株分别感染BHK-21、Vero和PK-15细胞后,观察CPE及利用本研究建立的荧光定量PCR方法分别绘制其在这三种细胞中的一步生长曲线。结果显示,JEV在这三种细胞中均能增殖且能产生不同程度的CPE:JEV感染BHK-21细胞后36h开始出现CPE,而感染Vero、PK-15细胞后48h开始出现CPE; JEV感染BHK-21细胞后0h-24h增长缓慢,24h-48h呈对数增长,48h-72h增长速度减缓,60h达到最大值,随后病毒含量逐步下降；感染Vero细胞后0h-12h增长缓慢,12h-48h呈对数增长,48h-72h增长速度减缓,维持在较高的水平,72h后病毒含量快速下降；感染PK-15细胞后0h-24h增长缓慢,24h-60h呈对数增长,60h-84h增长速度减缓,随后病毒含量逐步下降。同时比较这三条一步生长曲线发现JEV感染Vero细胞后的病毒滴度均较Vero、PK-15细胞高。结果表明JEV感染BHK-21细胞后出现CPE的时间较Vero、PK-15细胞早,感染Vero细胞后较BHK-21、PK-15细胞更快进入对数期且病毒滴度也更高。本试验为大规模生产疫苗提供理论支持,同时也为进一步研究JEV-SC-1株的生物特性奠定基础。利用高通量测序分析技术,鉴定感染与非感染JEV状态下PK-15细胞的miRNA并进行差异表达分析。结果显示,本研究共鉴定出 565个niRNA,其中在JEV感染PK-15细胞中共鉴定出522个1miRNA,在JEV未感染PK-15细胞中共鉴定出427个miRNA.同时获得了132个差异表达的miRNA,其中78个miRNA显著上调,54个miRNA显著下调。并通过荧光定量PCR方法对所选取的差异表达miRNA进行了验证。整合TargetScan和miRanda两个数据库的算法分别对上调与下调miRNA进行靶基因的预测。随后对这些差异表达miRNA的靶基因进行Gene Ontology (GO)分析,结果显示,这些差异表达的miRNA功能富集在许多复杂的细胞通路上,包括metabolic process, inflammatory response及immune response。该结果为进一步揭示miRNA在JEV感染过程中的作用及筛选抗JEV候选miRNA奠定了基础。本试验通过软件预测靶向病毒基因组的miRNA,并根据JEV感染PK-15细胞前后miRNA差异表达情况,选择了表达上调的mir-145-5p,表达下调的mir-744,差异表达谱中上调、下调水平最显著的mir-450a、mir-18a,与病毒基因组结合能力最强的mir-499-5p及目前研究报道具有潜在抗病毒能力的mir-10、mir-181a进行试验,以期筛选到能够抑制JEV复制的miRNA.将上述7个miRNA mimics及阴性对照mir-NC转入PK-15细胞6h后感染JEV (MOI为0.05),并以只接毒细胞组(NT)作对照,分别在病毒感染后12h、36h收取上清,然后统一提取总RNA进行qPCR检测。结果显示JEV感染细胞12h、36h后mir-NC组与NT组病毒含量差异均不大,表明：miRNA mimics及转染试剂对细胞无毒性作用,其中mir-145-5p、mir-499-5p、mir-18a及mir-450a均能不同程度抑制JEV的基因表达水平,而mir-499-5p抑制JEV能力最强。本试验结果为一步验证mir-499-5p抑制JEV复制的效果奠定基础,同时也为宿主miRNA作为抗病毒基因药物提供理论依据。
【关键词】：流行性乙型脑炎病毒 分离鉴定 microRNA PK-15细胞 病毒复制
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.31
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 主要缩略词9-12
• 第一部分 文献综述12-26
• 1 流行性乙型脑炎研究现状12-18
• 1.1 病原学12-14
• 1.1.1 病毒结构及功能12-13
• 1.1.2 病毒分型13
• 1.1.3 病毒培养特性及理化性质13-14
• 1.2 流行病学14-15
• 1.2.1 传播媒介14
• 1.2.2 流行动态及严重性14-15
• 1.3 病毒复制15-16
• 1.4 致病机理16-17
• 1.5 控制措施17-18
• 2 microRNA研究进展18-24
• 2.1 miRNA的产生18-19
• 2.2 miRNA的作用机制19-20
• 2.3 miRNA与病毒20-23
• 2.3.1 病毒编码的miRNA调控病毒和宿主基因表达20-22
• 2.3.2 宿主miRNA在病毒感染过程中的调节作用22-23
• 2.4 miRNA的鉴定方法23-24
• 3 目的与意义24-26
• 第二部分 实验部分26-62
• 第一章 乙型脑炎病毒的分离鉴定及增殖特性研究26-40
• 1 实验材料26-28
• 1.1 主要试剂26-27
• 1.2 主要培养基及其配制27
• 1.3 主要仪器27-28
• 2 实验方法28-31
• 2.1 引物设计与合成28
• 2.2 样品采集28
• 2.3 病料检测28
• 2.4 病料处理28-29
• 2.5 病毒分离29
• 2.6 病毒蚀斑纯化29
• 2.7 病毒株的鉴定29-30
• 2.8 病毒TCID_(50)的测定30
• 2.9 荧光定量PCR方法的建立30-31
• 2.10 JEV分别在BHK-21、Vero和PK-15细胞上的增殖规律31
• 3 实验结果31-37
• 3.1 病料检测结果31-32
• 3.2 病毒分离32
• 3.3 RT-PCR鉴定32-33
• 3.4 系统进化分析33-34
• 3.5 外源病毒检测34
• 3.6 病毒TCID_(50)的测定34-35
• 3.7 荧光定量PCR方法的建立35-37
• 4 讨论37-40
• 第二章 乙型脑病炎毒在microRNA水平上与PK-15细胞的相互作用研究40-62
• 1 实验材料40-41
• 1.1 毒株与细胞40
• 1.2 主要试剂40-41
• 1.3 主要仪器41
• 2 实验方法41-47
• 2.1 病毒感染41
• 2.2 细胞总RNA提取41
• 2.3 总RNA质量鉴定41-42
• 2.4 Illumina Solexa高通量测序42
• 2.5 测序结果生物信息学分析42-43
• 2.6 差异miRNA表达谱的构建43-44
• 2.7 荧光定量PCR分析44-46
• 2.8 差异表达miRNA靶基因预测和功能富集46
• 2.9 miRNA对JEV体外复制的影响46-47
• 3 实验结果47-56
• 3.1 总RNA提取及检测47
• 3.2 测序结果生物信息学分析47-50
• 3.3 差异表达的miRNA50-51
• 3.4 荧光定量PCR验证51-52
• 3.5 表达差异miRNA靶基因的预测与GO分析52-54
• 3.6 miRNA对JEV体外复制的影响54-56
• 4 讨论56-62
• 4.1 JEV感染PK-15细胞前后miRNA差异表达分析56-59
• 4.2 miRNA对JEV的抑制作用59-62
• 全文结论62-63
• 参考文献63-74
• 致谢74-75
• 附录75-101
• 附表1 在JEV感染与未感染PK-15细胞中miRNA的鉴定分析75-99
• 附表2 JEV感染PK-15细胞后差异表达的miRNA99-101
• 学术论文101-102

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