HUMSCs及其外泌体恢复非人灵长类NOA模型动物的生精功能

发布时间：2020-08-27 13:33

【摘要】：第一部分人脐带间充质干细胞及其外泌体的分离和鉴定[目的]从新生儿分娩后废弃脐带中分离出脐带间充质干细胞,通过成骨成脂定向诱导及表面标记检测等方法鉴定所获得的间充质干细胞;无血清培养脐带间充质干细胞,收集无血清培养上清,超速离心法获得外泌体,通过电镜、表面标记鉴定和粒径分析检测等方法鉴定所获得的外泌体。[方法]1.无菌条件下取足月健康新生儿脐带15cm左右,采用组织贴壁法分离出脐带间充质干细胞;2.对所获得的细胞进行传代纯化,通过细胞形态学、细胞表面标记和成骨成脂定向诱导等方法进行鉴定;3.利用无血清培养基培养所获得的脐带间充质干细胞,收集培养上清,超速离心法获得脐带间充质干细胞来源的外泌体;4.通过电镜、表面标记检测和粒径分析等方法对所获得的外泌体进行鉴定。[结果]1.显微镜下观察到,所获得的脐带间充质干细胞为大小均一、形态相似的长梭形,呈旋涡状生长;利用流式细胞仪检测到HUMSCs阳性标志物CD44、CD73、CD90、CD105表达率90%,阴性标志物CD34、CD45、HLA-DR4表达率为0;成骨诱导后茜素红染色呈阳性,成脂诱导后油红O染色呈阳性;免疫荧光结果显示CD45、CD90、CD105、CD29均在细胞内表达;2.所获得的HUMSCs来源的外泌体在电镜下呈脂质双层膜圆球状,大小均一、形状规则、均匀分布;流式细胞仪检测阳性表面标记CD9、CD63、CD81表达率分别在70%、50%、90%左右;粒径分析颗粒数与颗粒直径比呈正态分布,平均粒径135.5nm。[结论]1.组织贴壁法是获得脐带间充质干细胞的一种简便而稳定的方法,利用组织贴壁法可以获得纯度较高的HUMSCs;2.可通过超速离心无血清细胞培养上清的方法获得纯度较高、质量稳定的外泌体。第二部分 白消安致非人灵长类无精子症动物模型的建立[目的]通过静脉注射白消安,建立稳定的非人灵长类非梗阻性无精子症动物模型,为进一步研究人类男性非梗阻性无精子症提供理想的模型动物。[方法]1.随机选取青壮年雄性猕猴12只分为对照组和实验组;2.实验组收集储存静脉血,皮下注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF)后静脉注射白消安6mg/kg;3.白消安注射后,回输储血,再次皮下注射G-CSF;4.每隔两周检测猕猴精子数量和活力以及曲细精管结构等各项指标,并与对照组对比分析,观察白消安对猕猴生精功能的影响。[结果]1.白消安注射4周后,实验组猕猴死亡率为0;2.实验组猕猴体重无明显变化,与对照组相比血常规和生化结果无异常;3.实验组猕猴精液常规检测成熟活动精子计数为0;睾丸组织切片观察到曲细精管结构明显破坏,出现明显的“空泡样”改变,生精上皮细胞层数和细胞数量明显减少。[结论]1.白消安6mg/kg静脉注射可以成功建立猕猴非梗阻性无精子症模型;2.回输储血和皮下注射G-CSF可明显减轻白消安对猕猴造血系统功能的影响,降低死亡率。第三部分HUMSCs及其外泌体复案人灵长NOA动物的生精功能[目的]探讨脐带间充质干细胞( HUMSCS)及其外泌体对非人灵长类非梗阻性无精子症模型动物生精功能的恢复作用。[方法]1.随机选择12只青壮年猕猴,将其分为4组:干细胞 HUMSCS组、外泌体exosomes组、生理盐水sPss组和空白对照 control组2.其中干细胞组、外泌体组、生理盐水组孙猴单次静脉注射白消安6mgkg建立非梗阻性无精子症模型,并确定造模成功3.干细胞组睾丸曲细精管内移植人脐带间充质干细胞悬液;外泌体组睾丸曲细精管内注射外泌体悬液:生理盐水组睾丸曲细精管内注射生理盐水。4.第11周,分析对比各组猕猴间精子计数和活力、曲细精管组织结构变化,评估 HUMSCS及其外泌体对非梗阻性无精子症猕猴模型生精功能恢复作用。[结果]1.干细胞组和外泌体组猕猴精液中精子针相对于生理盐水组明显X椂唷⒒盍γ飨栽銮

本文编号：2806171