M13重组噬菌体的鉴定及其对沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用

发布时间：2020-08-27 16:48

【摘要】：【背景】沙眼衣原体泌尿生殖道感染是国内外常见的性传播疾病,且发病率逐年上升,近年来已居于性传播疾病的首位。据WHO统计,全世界每年大约新发沙眼衣原体感染约9200万。大约2/3的沙眼衣原体感染者没有临床症状,易被忽视,无法得到及时的诊治,引起一系列严重的并发症和后遗症。衣原体是一种区别于普通细菌的,具有特殊生物学特性的病原体,而临床上将其作为普通细菌,给予抗生素治疗,效果欠佳。衣原体噬菌体是一种以衣原体为宿主的噬菌体,部分衣原体噬菌体能引起宿主衣原体始体裂解性感染,并依靠简单的粘附作用传给下一代原体。利用衣原体噬菌体引起衣原体病变并使之裂解的特点,可将其作为生物制剂用于衣原体感染的治疗,但目前尚未发现沙眼衣原体的噬菌体。我们课题组前期研究发现将纯化的豚鼠嗜衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1作用于沙眼衣原体,能明显抑制体外沙眼衣原体感染,对Vp1蛋白结构进行分析发现,其含有七个插入环,其中一个较大的插入环-IN5环暴露在噬菌体衣壳蛋白表面形成蘑菇样的突起,推测Vp1蛋白的IN5环结构可能为最重要的功能区。【目的】探索M13-IN5重组噬菌体对E型沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用。【内容】鉴定M13-IN5重组噬菌体IN5环目的片段;检测M13-IN5重组噬菌体的效价;研究M13-IN5重组噬菌体IN5环蛋白的表达;将构建成功的M13-IN5重组噬菌体对沙眼衣原体E型标准株(CtE)和豚鼠嗜衣原体(Chlamydiadophila caviae)进行干预,利用光镜观察CtE在感染36h、48h、60h、72h的变化并检测各干预时间点噬菌体活性,利用免疫荧光显微镜观察豚鼠嗜衣原体在感染20h、24h、28h、32h的变化;利用激光扫描共聚焦显微镜精确定位M13-IN5重组噬菌体在Hela细胞内的位置。【方法】利用双层平板法检测重组噬菌体的效价。DNA提取试剂盒提取噬菌体DNA,进行PCR、酶切、测序,验证重组噬菌体。提取噬菌体蛋白,Western Blot检测重组噬菌体IN5环蛋白的表达。利用成功重组的噬菌体干预CtE,在CtE的培养过程中,加入效价均为10~(11)PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置CtE对照组和空白对照组,在干预36h、48h、60h、72h,普通光学显微镜下观察M13-IN5重组噬菌体对CtE作用;在干预36h,利用激光扫描共聚焦显微镜,观察M13-IN5重组噬菌体在Hela细胞内的位置;收集噬菌体干预实验各时段的培养基,用双层平板法检测噬菌体的效价,判断重组噬菌体的活力和重组噬菌体在干预各时段的存活情况。在豚鼠嗜衣原体的培养过程中,加入效价均为10~(11)PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置豚鼠嗜衣原体对照组和空白对照组,在干预20h、24h、28h、32h,通过免疫荧光显微镜观察M13-IN5重组噬菌体对豚鼠嗜衣原体的作用。【结果】利用DNA重组技术获得M13-IN5重组噬菌体,挑取单克隆扩增M13-IN5重组噬菌体,通过噬菌斑计数得到M13-IN5重组噬菌体滴度,LB平板培养显示,M13-IN5重组噬菌体噬斑形成单位PFU=3.05×10~(11)/ml,提示M13-IN5重组噬菌体具有生物活力。M13-IN5重组噬菌体在大小约55kDa处有一较浓的蛋白带,其大小正好与IN5环和M13噬菌体pIII外壳蛋白的融合蛋白(58.2kDa)大小相当,M13噬菌体组和大肠杆菌ER2738组在相应位置无条带,这说明重组噬菌体IN5基因能够正常表达。激光扫描共聚焦定位显示,M13-IN5重组噬菌体荧光与CtE包涵体荧光存在重叠。M13-IN5重组噬菌体对CtE及豚鼠嗜衣原体均有抑制作用;CtE感染36、72 h时,M13-IN5重组噬菌体组和M13噬菌体组的包涵体数目较CtE对照组降低(P0.05),而且M13-IN5重组噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组有明显降低(P0.05),而感染48 h、60h时,M13-IN5重组噬菌体组、M13噬菌体组、CtE对照组包涵体数目无明显区别(P0.05);在豚鼠嗜衣原体感染中也出现沙眼衣原体干预实验类似的结果,豚鼠嗜衣原体感染28h、32h,M13-IN5重组噬菌体组和M13噬菌体组的包涵体数目较豚鼠嗜衣原体对照组降低(P0.05),而且M13-IN5重组噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组明显降低(P0.05),豚鼠嗜衣原体感染20h、24h,M13-IN5重组噬菌体组、M13噬菌体组、豚鼠嗜衣原体对照组包涵体数目无明显区别(P0.05)。【结论】M13-IN5重组噬菌体具有生物活性,且能够成功表达IN5环蛋白;在体外实验中,M13-IN5重组噬菌体能进入衣原体包涵体内,且能明显抑制增殖期的沙眼衣原体E型标准株和生长周期晚期的豚鼠嗜衣原体感染。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R374
【图文】：

酶切鉴定 1.DNA 标准带；2.M13 噬菌体（体（分子量 7462bp）；4.M13-IN5 重组噬菌量分别在 4827bp 、 2622bp 处）测序由苏州金唯智力生物科技有限公司完成，的 IN5 环基因序列。目的蛋白表达的鉴定菌体组在 55kDa 处有一较浓的蛋白带（图II 外壳蛋白的融合蛋白（58.2kDa）大小相当 组在相应位置无条带。这说明重组噬菌体 I印迹鉴定 M.蛋白分子量标记物； 1.IN5 环肠杆菌 ER2738

图 1.2 重组噬菌体酶切鉴定 1.DNA 标3.M13-IN5 重组噬菌体（分子量 7462bp成的 DNA 片段分子量分别在 4827bp 、1.2.2.3 重组噬菌体测序重组噬菌体测序由苏州金唯智力生示重组噬菌体含有目的 IN5 环基因序列1.2.2.4 重组噬菌体目的蛋白表达的鉴M13-IN5 重组噬菌体组在 55kDa 处环和 M13 噬菌体 pIII 外壳蛋白的融合蛋和大肠杆菌 ER2738 组在相应位置无条表达。

纯化的E型沙眼衣原体各稀释倍数碘染观察图（400×）

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本文编号：2806359