肠道微生物加重机械性创伤病理及其机制探讨

发布时间：2020-08-28 00:30

【摘要】：目的:建立果蝇与小鼠机械创伤模型;探讨肠道微生物在机械性创伤病理过程中作用及潜在的机理。方法:1.以黑腹果蝇为实验对象,采用自由落体方法建立机械性创伤模型,通过24小时死亡指数评价机械性创伤的结果;以C57BL6雄性小鼠为自由落体创伤模型,对照组20只,实验组20只,分别测定机械性创伤后24 h和48 h小鼠的存活率。2.以CR果蝇为实验对象,采用运动能力测定装置,测定机械性创伤后果蝇的运动能力;以C57BL6雄性小鼠为实验对象,对照组5只,实验组20只,分别测定对照组、机械性创伤后瞬间、机械性创伤后20 min和40 min小鼠的奔跑速度和攀爬频率。3.以C57BL6雄性小鼠为实验对象,对照组5只,实验组20只,机械性创伤后,分别对对照组、机械性创伤后24 h与机械性创伤后48 h结肠组织取样,并用Image J软件对其结肠组织的长度和宽度测量。4.以CR、GF、OAC和E.coli果蝇为实验对象,各分为对照组和实验组,机械性创伤后,采用浓度梯度稀释涂板法检测各组果蝇肠道载菌量;以C57BL6雄性小鼠为实验对象,对照组5只,实验组20只,分别对对照组、机械性创伤后24 h与机械性创伤后48 h结肠组织取样,每组5个组织样品,液氮速冻,干冰低温保存,16S rDNA测序。5.以CR、GF、OAC和E.coli果蝇为实验对象,测定机械性创伤后24小时果蝇死亡指数。6.以CR、GF、OAC和E.coli果蝇为实验对象,各分为对照组和实验组,机械性创伤后,采用染料渗透性试验检测机械性创伤后肠道屏障功能。7.以CR、GF、OAC和E.coli果蝇为实验对象,机械性创伤后,采用实时荧光定量PCR技术检测每组果蝇体内Attacin-C、Diptericin B基因的表达水平;以C57BL6雄性小鼠为实验对象,机械性创伤后,采用实时荧光定量PCR技术检测小鼠结肠组织中炎性细胞因子TNF-α、lL-6、lL-10和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达水平。8.以CR果蝇为实验对象,机械性创伤后分为对照组和实验组,对照组用5%蔗糖处理,实验组用混合抗生素处理,24小时后分别测定死亡指数、运动能力、SI_(24)百分率、肠道载菌量和免疫基因Attacin-C和Diptericin B基因的表达水平等指标。结果:1.建立自由落体创伤模型,该模型具有代表性强,操作简单易行,可重复性高等优点。2.自由落体创伤增加黑腹果蝇死亡率,死亡指数随着自由落体高度和机械性创伤次数的增加而增加,与对照组相比,具有显著的统计学差异(P0.001)。优化出以15 m为自由落体机械性创伤模型的高度。小鼠机械性创伤后24 h和48 h存活率分别为85%和75%。3.机械性创伤降低创伤模型的运动能力。结果显示CR果蝇机械性创伤后奔跑速度和攀爬速度下降(P0.01,P0.001)。C57BL6雄性小鼠在机械创伤后瞬间、机械创伤后20 min和40 min,奔跑速度和攀爬频率下降(P0.01,P0.01,P0.01);小鼠在机械性创伤后的瞬间攀爬的频率为0,机械性创伤后20 min和40 min,攀爬频率与对照组相比差异具有统计学差异(P0.001,P0.001)。3.C57BL6雄性小鼠对照组、机械性创伤后24 h与48 h结肠组织宽度测定显示:随着机械性创伤后时间的延长,结肠组织宽度增加(P0.05,P0.001),结肠组织长度无统计学差异(P0.05)。4.16S rDNA测序显示:厚壁菌丰富度在机械性创伤后的24 h内增加(P0.05),而在之后的48 h内降低,但仍高于对照组;拟杆菌丰富度在机械性创伤后的24 h内降低(P0.05),48 h内比创伤后24 h时丰富度增加,但仍低于对照组;疣微菌群丰富度在机械创伤后的24 h达到最高水平(P0.05);放线菌的菌群丰富度并无很大的变化;变形菌的菌群丰富度在机械创伤后24 h和48 h呈现增加的趋势。PCA分析显示对照组、机械性创伤24 h和48 h的菌种群落分布具有较大的差异性,但每个组别中的样本的群落分布具有相似性。物种相关性结果显示:在属水平总丰度前50物种中,厚壁菌和变形菌与其他的物种相关性较密切,而拟杆菌和放线菌与其他的物种相关性较低。5.肠道载菌量结果显示机械性创伤后在CR、OAC和E.coli果蝇中,肠道载菌量均增加。CR果蝇实验组每只果蝇的肠道载菌量为(20.73±2.41)×10~6 CFU(P0.001);OAC果蝇实验组每只果蝇的肠道载菌量为(2.46±0.36)×10~6 CFU(P0.01);E.coli果蝇实验组每只果蝇的肠道载菌量为(24.67±0.94)×10~6 CFU(P0.01)。6.机械性创伤后果蝇模型中显示:GF果蝇死亡指数低于CR果蝇,而补加OAC或E.coli又增加了GF果蝇的死亡指数(P0.001,P0.001),说明肠道微生物加重了机械性创伤的严重程度。7.染料渗透性试验结果显示:机械性创伤后24 h,CR果蝇出现Smurf现象百分率为(38.00±2.86)%(P0.001);GF、OAC和E.coli果蝇出现Smurf现象的百分率与其对照组相比,有统计学差异(P0.01,P0.01,P0.001),说明机械性创伤导致了肠道屏障功能紊乱,引起肠道屏障通透性增加。而CR、OAC和E.coli果蝇SI_(24)百分率与GF果蝇相比,有统计学差异(P0.001,P0.01,P0.01),说明肠道微生物的参与加重了机械创伤诱导的肠道屏障功能紊乱,导致肠道屏障通透性进一步增加。8.实时荧光定量PCR结果显示:机械性创伤后,GF果蝇体内Attacin-C、Diptericin B基因的表达水平与对照组相比明显升高(P0.05,P0.01);CR、OAC和E.coli果蝇中两种基因的表达量均有升高。小鼠结肠组织中炎性细胞因子TNF-α、lL-6、lL-10的表达水平与对照组相比明显升高(P0.01,P0.05,P0.05),说明机械性创伤引起小鼠肠道组织炎性反应;紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达水平与对照组相比明显升高(P0.001,P0.01),说明创伤引起小鼠肠道屏障通透性增加。9.抗生素处理结果显示CR果蝇的死亡指数降低(P0.001);果蝇奔跑速度和攀爬速度与对照组相比提高(P0.001,P0.05);果蝇肠道载菌量降低(P0.01);SI_(24)百分率下降(P0.001),说明抗生素的处理减轻了机械性创伤对果蝇肠道屏障的损害;Attacin-C、Diptericin B基因的表达水平下降(P0.05,P0.01)。说明抗生素的干预降低了机械性创伤的严重程度。结论:本研究通过自由落体方法建立果蝇和小鼠创伤模型,进一步探讨肠道微生物群加重机械性创伤病理及其潜在机制。研究结果显示机械性创伤引起机体病理性质的改变并进一步引起肠道微生物的组成与功能改变;肠道微生物加重机械性损伤诱导的肠屏障功能紊乱并刺激了机械性创伤诱导的先天性免疫反应和肠道炎症。抗生素干预可以减轻机械性创伤病理。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R641
【图文】：

果蝇,装置模型,创伤,高强度

弹簧的一端固定在小板的一侧，另外一端连垫；当弹簧偏转并释放时（图 A）小管迅速接触聚小管壁后反弹（图 B）。图 C 为机械性创伤之前果蝇受机械性创伤后出现暂时性的晕厥，果蝇大部分易操作，并且可以在任意时刻观察果蝇的状态，但也作用时，冲击面有弧度，导致果蝇受力不均匀；2）集成堆，下层的果蝇对上层的果蝇具有缓冲作用。3型的不足，我们做了进一步的改进：装置如图（附理为自由落体运动，将带有果蝇的小管从不同高度自果蝇在机械性撞击瞬间受到的机械性损伤随自由落底端先触底，特意用切片石蜡将医用砂轮固定在小落体速度与位移公式：Vt= 2 gh。

果蝇,存活率,指数,性创伤

械性创伤引起病理性结果械性创伤降低果蝇和小鼠存活率果蝇自 3 m、9 m、15 m 和 18 m 等不同的高度自由落体，测定机数。结果显示，随着自由落体高度的增加，果蝇死亡指数呈现增体的高度为 15 m 时，死亡指数为（55.33 ± 1.15）%，而对照组 ± 0.99）%，不同高度实验组死亡指数与对照组相比较均有显著0.001）。由于 15 m 高度死亡指数超过 50 %，所以后续实验均选到不同次数的机械创伤，其 24 h 死亡指数呈现增加的趋势，机为 1 h。当机械创伤次数为 4 次时，果蝇的死亡指数为（85.83 ±。以 15 m 为机械性创伤高度的基点，小鼠在相同高度机械性创5%，机械性创伤后 48 h 存活率为 75%。以上结果说明，机械性高度增加而增加，与我们的预期和实际相符合，说明这个模型具。

小鼠,创伤后,果蝇实验,对照组

山西医科大学硕士学位论文性创伤模型中结果显示对照组小鼠的运动速度为（2.85 ± 0.61），其速度为（0.13 ± 0.06）cm/s（P < 0.01）；机械创伤后 20 分钟为（0.19 ± 0.06）cm/s（P < 0.01）；机械创伤后 40 分钟，小鼠的± 0.05）cm/s（P < 0.01）。对照组小鼠的攀爬频率为（13.50 ± 0瞬间，小鼠的攀爬频率为 0；机械创伤后 20 分钟，小鼠的攀爬频t/m，与对照组相比较有显著的统计学意义（P < 0.001）；机械创攀爬频率为（0.75 ± 0.75）t/m（P < 0.001）。以上结果说明，机小鼠运动能力下降。

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