基于均相免疫分析技术检测蛋白质相互作用的方法建立及其在新药研发中的应用
发布时间：2020-08-31 20:45
探索生命的奥秘,揭开生老病死的神秘面纱一直是人类在生命科学领域的伟大愿景。深入研究蛋白质之间的相互作用、搭建蛋白质相互作用的网络是直接阐明生理或者病理条件下各种生物学活动的重要一环。目前,研究蛋白质相互作用的方法主要包括免疫共沉淀、GST Pull-down、酵母双杂交技术、表面等离子共振技术等。虽然这些方法可以满足大多数科研要求,但一定程度上存在各自的不足,不利于经济高效地检测蛋白质之间的相互作用。谈及经济高效的检测方法,免疫分析技术是目前应用最广的方法。其中光激化学发光免疫分析技术(AlphaLISA)作为一种新型的均相免疫分析技术具有高灵敏度、高通量、无需洗涤等优点。本课题旨在探索AlphaLISA技术在快速检测蛋白质相互作用上的应用,建立新型的研究蛋白质之间相互作用的方法。本研究以p53蛋白为例,尝试建立快速检测它与相关蛋白之间相互作用的方法。因为p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,而且目前其相关研究论文多达8000余篇,相互作用网络相对完整。本研究内容主要分为几部分:实验原材料的制备,包括p53和相互作用蛋白的表达以及相互作用情况的验证,尤其是筛选检测所需的特异性抗体;采用双抗体夹心法,探索光激化学发光免疫分析技术检测细胞裂解液中靶分子的可行性;采用竞争法,利用光激化学发光免疫分析技术检测p53蛋白与相关蛋白质之间的相互作用;探索光激化学发光免疫分析技术在新药筛选中的应用,建立高通量筛选p53-MDM2抑制剂的免疫分析方法。结果如下:(1)成功构建p53、MDM2、MDM4及其它相关的表达质粒,并利用GST pull-down技术验证p53与MDM2、MDM4等的相互作用;(2)筛选到了与MDM2竞争性结合p53的单克隆抗体株;(3)成功制备了尺寸、悬浮性质优异的偶联了 p53抗体的发光微球;(4)成功建立了基于AlphaLISA技术快速检测细胞裂解液中p53-his融合蛋白的方法,摸索出了最优的反应时间以及各组分的最优浓度,绘制了剂量-效应曲线;(5)采用竞争法模式成功检测到p53与MDM2和MDM4的相互作用,可见随着MDM2/MDM4蛋白增加,体系中游离的p53逐渐减少,检测信号值随之下降;另外该方法可用于高通量快速筛选p53的负调控蛋白;(6)成功建立了高通量筛选p53-MDM2抑制剂的AlphaLISA方法,6种已知的抑制剂均能被该方法有效检测到,并且具有很好的特异性;(7)成功真核表达p53相互作用蛋白共计15个,并利用GST pull-down技术验证其与p53蛋白之间的相互作用。本研究创新性地将免疫分析技术与蛋白质相互作用进行有机结合,建立了经济高效地检测蛋白质之间相互作用的新型分析方法,并成功将这一方法应用到了新药研发中,极具开发前景。该方法相较于现有的研究蛋白质相互作用的技术方法具有所需待测样品少、待研究蛋白无需纯化、实验耗时短、易于高通量等优点,为今后实现快速、经济、自动化以及高通量地检测蛋白质之间相互作用、筛选新的药物前体提供了科学依据,相信其具有广阔的应用前景。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392-33
【部分图文】：
光激化学发光免疫分析技术根据发光物质不同又可分为ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ和逡逑ｌｐｈａＬＩＳＡ技术。在ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ分析法中这一发光物质为红荧q妫旆倭兜姆㈠义喜ㄆ缀芸恚⑸涑鲂藕挪ǔし段担玻埃叮玻埃睿恚虼嗽诩觳庑藕攀北匦胍褂缅义瞎馄聪し⒐庠吹母扇拧６液煊┦粲谟谢玖希灾什晃榷ǎ蒎义弦妆湫蔚贾路治鼋峁榷ㄐ圆睢：罄矗校澹颍耄椋睿牛欤恚澹蚬驹冢粒欤穑瑁幔樱悖颍澹澹罘治龇ǖ腻义洗≈峡⒘隋澹粒欤穑瑁幔蹋桑樱良际酰捎孟⊥猎仡穑ǎ牛酰├刺娲吹姆⒐馕镥义虾煊鸬姆⑸洳ǔし浅＜馊裎叮保担睿恚郏担罚担福荨６业靡嬗诟泄馕⑶蚝头⒐忮义锨虻牧＞对嘉玻埃埃睿怼⒈砻婢似暇厶腔肀苊饬宋⑶虻姆翘匾煨跃奂㈠义霞由戏从μ逑抵形⑶蚺ǘ群艿拖嗷ニ婊鲎驳募嘎屎苌伲粒欤穑瑁幔蹋桑樱良际醣镜族义系停灾岣吡诵旁氡取ｅ义希瑰义
本文编号：2809296
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392-33
【部分图文】：
光激化学发光免疫分析技术根据发光物质不同又可分为ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ和逡逑ｌｐｈａＬＩＳＡ技术。在ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ分析法中这一发光物质为红荧q妫旆倭兜姆㈠义喜ㄆ缀芸恚⑸涑鲂藕挪ǔし段担玻埃叮玻埃睿恚虼嗽诩觳庑藕攀北匦胍褂缅义瞎馄聪し⒐庠吹母扇拧６液煊┦粲谟谢玖希灾什晃榷ǎ蒎义弦妆湫蔚贾路治鼋峁榷ㄐ圆睢：罄矗校澹颍耄椋睿牛欤恚澹蚬驹冢粒欤穑瑁幔樱悖颍澹澹罘治龇ǖ腻义洗≈峡⒘隋澹粒欤穑瑁幔蹋桑樱良际酰捎孟⊥猎仡穑ǎ牛酰├刺娲吹姆⒐馕镥义虾煊鸬姆⑸洳ǔし浅＜馊裎叮保担睿恚郏担罚担福荨６业靡嬗诟泄馕⑶蚝头⒐忮义锨虻牧＞对嘉玻埃埃睿怼⒈砻婢似暇厶腔肀苊饬宋⑶虻姆翘匾煨跃奂㈠义霞由戏从μ逑抵形⑶蚺ǘ群艿拖嗷ニ婊鲎驳募嘎屎苌伲粒欤穑瑁幔蹋桑樱良际醣镜族义系停灾岣吡诵旁氡取ｅ义希瑰义
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