恒河猴白介素22和XC趋化因子1的研究

发布时间：2020-09-16 07:28

　　 HIV-1感染会导致肠道固有层CD4+T淋巴细胞的大量损耗,引起肠道相关免疫系统结构和功能的异常、肠道上皮屏障损伤、微生物移位和持续的免疫激活。因此,HIV-1感染也被视为一种肠道疾病。增强肠道固有免疫以及在肠道部位建立特异的抗HIV-1免疫对HIV/AIDS防治具有重要意义。IL-22-IL-22RI和XCL1-XCRI是肠道粘膜免疫屏障维持和调节的重要细胞因子通路。已有研究证明IL-22-IL-22R1通路在炎症、抗病原菌感染和肠上皮组织维持和修复等方面具有重要作用,是粘膜系统重要的固有免疫分子,具有潜在的治疗性调节作用。XCL1-XCR1不仅能调节肠道T淋巴细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)细胞组成,而且还在肠道内抗原递呈和维持肠道免疫稳态中起重要作用。不仅如此,XCL1也被认为是有效的粘膜免疫佐剂。这些研究结论无疑都是在小鼠模型中得到的,而恒河猴作为人类疾病,特别是HIV-1研究不可替代的实验动物模型,其IL-22-IL-22R1和XCL1-XCR1通路的生物学特性目前仍知之甚少。为更好的利用恒河猴研究IL-22通路分子在HIV-1感染过程中肠道粘膜相关损伤修复中的作用以及XCL1在HIV-1疫苗创制中的应用前景。本研究做了以下几点工作:1、为了解恒河猴IL-22及其受体IL-22R1的分子特性及功能,本研究采用RT-PCR和RACE扩增方法首次克隆了 IL-22和IL-22R1cDNA核苷酸序列。IL-22 cDNA 全长 1163bp 包括 69bp-5'UTR,540bp-ORF 和 554bp-3'UTR。通过匹配基因组发现IL-22基因含有5个外显子,位于恒河猴第11号染色体上,与IFN-γ和IL-26等基因形成IFN/IL-10相关细胞因子基因簇。IL-22R1 cDNA全长2802bp(32bp-5'UTR 1725bp-ORF和1045bp-3'UTR)。通过匹配基因组发现IL-22R1基因含有7个外显子,位于第1号染色体上,而启动子分析显示IL-22R1没有保守的TATA启动元件,但在启动子上游序列分布着两个CpG岛。通过氨基酸序列比对发现恒河猴IL-22和IL-22R1与人IL-22和IL-22R1的氨基酸序列相似性分别为95.5%和96%。不仅如此,与IL-22结构和功能密切相关的保守位点如半胱氨酸、糖基化位点以及配体-受体结合位点均与人 IL-22/IL-22R1 一致。2、运用实时荧光定量RT-PCR方法分析了IL-22 IL-22R1mRNA分子在正常恒河猴组织中的表达分布,发现IL-22和IL-22R1mRNA在肠道各部位均呈现高水平表达,预示着IL-22-IL-22R1在肠道免疫系统中发挥重要作用。为进一步研究恒河猴IL-22的肠道相关功能,并比较其与人IL-22的差异。本研究利用原核表达系统体外表达并纯化获得了具有功能活性的重组恒河猴IL-22。通过体外刺激肠上皮细胞进行功能性实验,发现表达的恒河猴IL-22与人IL-22均能激活下游信号分子STAT3发生Tyr705磷酸化,而对Ser727磷酸化无影响。而相比于人IL-22,恒河猴IL-22引发的STAT3 Tyr705磷酸化出现的峰值稍早。另外,恒河猴IL-22和人IL-22都能促进上皮细胞多种抗菌肽的表达,如BD-2,S100A8,S100A9,RegⅢα以及Muc1。不仅如此,恒河猴IL-22在低浓度下促进细胞增殖,而在高浓度下却显示出抑制细胞增殖效应,而凋亡实验证明IL-22对肠上皮细胞的凋亡和抗凋亡相关蛋白表达没有明显影响。3、为了解SIV/SHIV感染后IL-22及其相关分子的病理变化。本研究首先通过实时荧光定量RT-PCR方法检测SIV/SHIV感染前后肠道六个(十二指肠近端、空回肠近端、回肠、盲肠、结肠近端和直肠)组织部位中IL-22和IL-22R1 mRNA的表达变化,结果发现在结肠部位IL-22 mRNA存在显著下调,而其受体IL-22R1 mRNA的表达却出现明显上调。结合已有文献报道,乙型结肠和结肠部位表达IL-22的细胞Th17、Th22以及ILC3s均发生大量的损耗,从而影响了 IL-22的表达。其受体IL-22R1呈现相反的变化趋势,这其中的分子机制,以及上调表达的IL-22R1所产生的生理学效应值得探究。4、为研究IL-22R1的上调表达的机制,以出现明显表达变化的结肠部位做进一步的研究。通过筛选多个炎症因子的表达,发现IL-1β呈现与IL-22R1同步上调表达,并且具有显著相关性。经体外IL-1β刺激HT-29细胞实验证明IL-1β在转录水平上能显著上调细胞IL-22R1的表达,并且具有浓度依赖性。RNA稳定性实验表明,IL-1β刺激细胞与不刺激组细胞内IL-22R1具有几乎一致的降解曲线。同样通过Luciferase启动子报告实验也未能观测出IL-1β单独刺激对IL-22R1启动子活性的影响。基于SIV/SHIV感染后粘膜受损所产生的复杂的微环境,包括高水平的LPS、炎症因子以及病毒蛋白分子等,本研究体外模拟LPS及Gp140等因子协同IL-1β刺激肠上皮细胞,发现相比IL-1 β单独刺激以及LPS+Gp 140共刺激组细胞,协同刺激组细胞IL-22R1的表达大幅度的上调,而Luciferase启动子报告实验证明,IL-22R1基因启动子在LPS、Gp140和IL-1β协同刺激下发生了明显的激活。5、为进一步探究SIV/SHIV感染后IL-22与其受体IL-22R1呈现相反的变化趋势,其下游信号分子及相关抗菌肽表达变化。我们进一步对IL-22主要信号分子STAT3的表达及磷酸化进行检测,结果发现,无论是mRNA还是蛋白表达水平,感染后STAT3的表达均显著性上调。不仅如此,STAT3在SIV/SHIV感染后出现更为明显的Tyr705磷酸化。当继续筛选下游抗菌肽和粘蛋白分子的表达后发现,粘蛋白Muc1与STAT3出现同步性的上调表达。与此同时,为研究SIV/SHIV感染后上调表达的IL-22R1的生物学效应,本研究利用腺病毒包装技术将IL-22R1基因导入到肠上皮细胞内,构建体外过表达IL-22R1细胞模型。在等量的IL-22刺激后,过表达细胞会诱导更强的STAT3信号激活,而且相比腺病毒对照细胞,过表达IL-22R1细胞在继续培养2d后即出现更为明显的细胞增殖能力。6、为利用XCL1作为粘膜佐剂以及携带抗原靶向特异性CD8+DCs细胞,增强体液免疫和细胞免疫应答的作用,并探讨其在HIV-1粘膜疫苗创制中的应用。首先,本研究克隆获得了恒河猴XCL1及其特异性受体XCR1 cDNA序列,分析并比较其与人XCL1和XCR1的分子高度相似。其次,扩增XCL1 C端融合优化的SIVmac239毒株V1V2模式抗原序列,并插入p1.0疫苗载体构建真核表达p1.0-XCL1-linker-V1V2质粒。同时还构建单独表达XCL1和V1V2以及结构突变型质粒LVC11A。通过流式细胞术和Western blot证实各疫苗质粒转染后能表达相关蛋白。其次,为加强粘膜免疫应答,本研究将四个疫苗质粒用壳聚糖包裹形成纳米微球,通过凝胶阻滞和包裹率分析证实疫苗质粒均能有效的包裹在壳聚糖内。透射电子显微镜观测显示包裹的壳聚糖-质粒形成的微球大小均一(200-350nm)。通过DNaseI酶消化实验证实包裹后的纳米微球能有效保护质粒DNA的酶解。最后,将各壳聚糖-DNA包裹形成的纳米微球通过鼻腔喷雾形式免疫恒河猴。三次免疫后相关抗体水平检测结果显示,血清中IgG和口腔中IgA产生较弱。而在肠道总IgA和特异性抗V1V2区IgA均显著上调,而且LV靶向质粒免疫组相比单独V1V2免疫组具有显著差异。另外,通过XCL1携带V1V2结构域的DNA鼻腔免疫也能引起更强的细胞免疫应答。综上所述,本研究克隆获得了恒河猴IL-22及其受体IL-22R1的序列,并比较其在序列特征、组织表达方面与人IL-22和IL-22R1的相似性。同时体外研究证明恒河猴IL-22具有活化肠上皮细胞STAT3信号分子、上调抗菌肽表达及增强细胞增殖等肠道相关功能,为利用恒河猴IL-22开展肠道疾病研究提供基础。本研究全面分析了SIV/SHIV感染对肠道IL-22、IL-22R1、炎症因子、及其下游信号分子和抗菌肽的表达影响,体外论证了 IL-1β在LPS和Gp140的协同作用下通过活化IL-22R1启动子活性上调IL-22R1的表达。而过表达的IL-22R1赋予细胞更强的信号活化和细胞增殖能力,为进一步了解HIV-1感染后导致的肠道病理机制提供基础。本研究利用XCL1作为粘膜佐剂的特性,以及携带V1V2模式抗原靶向特异性XCR1+DCs的特性,并结合纳米包裹技术鼻腔免疫获得明显的肠道总IgA和特异性抗V1V2 IgA水平,为推进HIV-1疫苗在增强粘膜免疫应答方面提供借鉴。
【学位单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

肠道,细胞,肠上皮细胞,感染后

图１丨Ｌ－２２在肠道黏膜系统中的作用｜５］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＩＬ－２２邋ｉｎ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｍｕｃｏｓａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑慢性ＨＩＶ－１感染导致乙型结肠产ＩＬ－２２邋Ｔ淋巴细胞和Ｔｈ２２细胞急剧下降，并伴逡逑随明显的肠道上皮细胞受损和微生物移位。相比未感染的ＣＤ４＋Ｔ细胞，循环Ｔｈ２２细逡逑胞高表达ＨＩＶ－１共受体ＣＣＲ５和整合素（Ｘ４Ｐ７邋（淋巴细胞向肠淋巴组织定向归巢的特逡逑异性受体，可与ｇｐ－１２０蛋白结合分子）。因此，Ｔｈ２２细胞是ＨＩＶ－１更易感的细胞表逡逑型。体外肠上皮细胞培养刺激实验表明，重组ＩＬ－２２蛋白能抵御ＨＩＶ－丨和ＴＮＦ－ａ诱导逡逑的肠上皮细胞损伤｜２２１。因此，重组ＩＬ－２２蛋白对ＨＩＶ感染后造成的肠粘膜损伤和继逡逑发性细菌感染等方面的治疗性作用值得期待。逡逑如上所述，ＩＬ－２２作为肠道固有免疫重要分子，并且在ＨＩＶ－１感染后粘膜修复和逡逑抗菌感染过程中具有潜在应用前景。尽管有许多研究表明，在Ｈ１Ｖ－１感染或Ｓ１Ｖ／ＳＨＩＶ逡逑感染模型中产ＩＬ－２２的细胞急剧下降，包括Ｔｈ２２细胞、Ｔｈｌ７细胞、ＮＫｐ４４＋ＮＫ细胞逡逑和ｌＬＣ３ｓ细胞等，并伴随肠上皮细胞的损伤和持续免疫激活１２３邋２４１。而对决定ＩＬ－２２功逡逑

恒河猴,启动子,基因组,基因

中国疾病预防控制中心博士学位论文逦第一部分实验结果逡逑通过匹配基因组序列发现，恒河猴／Ｉ－２２基因位于丨１号染色体的负链上，包含６逡逑个外显子和５个内含子。１Ｌ－２２基因与ＩＦＮ－ｙ、ＭＤＭ１和ＩＬ－２６相邻，并形成一个逡逑ＩＬ－１０／ＩＦＮ相关细胞因子簇（图１－２Ａ）。通过启动子序列预测发现，／Ｚ－２２基因含有两逡逑个潜在的ＴＡＴＡｂｏｘ邋（位于ＴＳＳ上游的－３８２ｂｐ和－２２ｂｐ），由于－２２ｂｐ处的ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ同逡逑时还是ＣＣＡＡＴ增强结合蛋白（Ｃ／ＥＢＰＰ）和转录因子结合域（ＴＦＩＩＤ）结合位点，而逡逑更可能是真正的启动子。另外，也同样预测到／Ｉ－２２基因启动子附近序列还存在其他逡逑的转录因子结合位点，如：ＦｏｘＰ３，ＹＹ１，邋ＮＦ－ＡＴ１和ＧＡＴＡ－１和３等（图１－２Ｂ）。逡逑ＡｉＩＦＮＧ逦ｔ逦丨Ｌ－２６逦ｉ邋ＩＬ－２２ｋ逦ＭＤＭ１逡逑

序列,启动子上游,序列,核苷酸序列

２６１１邋ＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣｒｒＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧ逡逑２＾０１邋ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧ邋了邋Ｃ：ＡＴＧＴＣＴＴＴ／＾ＧＣＧＣｎ，ＴＡＡｉｍＴＧＣＣＴＧＡＴＡＣ＾ＣＣ；ＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣ＾Ｔ／ｉＡ／ｊ：ＧＧＴＧＧＣｒＡＴＴＴ＾ｖＡＡＡ／＼ＡＡ，＾ＷｖＡ．逡逑图１－５邋／Ｌ－２２Ｗ邋ｃＤＮＡ核苷酸序列及其推测的氨基酸序列逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ａｎｄ邋ｄｅｄｕｃｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｒｈｅｓｕｓ邋ｍａｃａｑｕｅ邋ＩＬ－２２Ｒ１邋ｃＤＮＡ逡逑Ｔｈｅ邋ｐｒｏｂａｂｌｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｉｎ邋ｄａｒｋ邋ｇｒｅｙ．邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｒｏｎｓ邋ａｒｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｂｙ逡逑ａｒｒｏｗｓ．邋Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｓｉｔｅｓ邋ａｒｅ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ邋ａｎｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ逡逑ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎａｌｓ邋（ＡＡＴＡＡＡ）邋ｉｓ邋ｂｏｘｅｄ．逡逑３９逡逑

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