基于miRNA的间充质干细胞干性维持机制及应用研究

发布时间：2020-09-29 17:37

　　 间充质干细胞(MSCs)是细胞治疗重要的种子细胞,在心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等衰老相关疾病的治疗中间充质干细胞表现出引入注目的潜能。间充质干细胞治疗的首要条件是在质量和数量上满足临床要求。一方面,体外扩增过程引起的细胞衰老和功能衰退是间充质干细胞培养的主要障碍,研究mi RNA对间充质干细胞干性维持和衰老的作用为解决间充质干细胞的规模化扩增问题提供了新的思路。另一方面,间充质干细胞组分在抗衰老应用中的有效性也需要进一步研究。本论文就这些问题展开研究,取得了以下成果:1.基于mi RNA表达谱探讨了mi RNA对间充质干细胞衰老的作用机制。我们利用高通量测序技术比较了脐带间充质干细胞培养早期和培养晚期两个阶段的mi RNA表达谱特征。通过建立mi RNA与靶基因的作用模型,我们分析了mi RNA表达谱对靶基因表达的影响。对衰老前后差异表达的靶基因进行功能聚类分析后我们揭示了mi RNA在间充质干细胞衰老过程中重要的调节作用。2.深入研究了mi R-18a在间充质干细胞衰老中的作用机制,提出了一种通过mi R-18a的持续表达减缓衰老、维持间充质干细胞自我更新和生物学功能的方法。我们发现内源性的mi R-18a在间充质干细胞的高表达是细胞抵御衰老的关键因素。通过荧光素酶报告基因实验和免疫印迹实验我们首次证明mi R-18a通过直接靶向CTDSPL的3’非编码区抑制了CTDSPL的表达,从而抑制了CTDSPL诱导的细胞衰老。最后我们通过慢病毒感染使mi R-18a在间充质干细胞中稳定表达,证明了mi R-18a的持续表达降低了细胞中活性氧的水平,减缓了间充质干细胞的衰老过程,同时促进了干细胞基因的上调,增强了细胞的生长活性和多向分化能力。3.比较了脐血与脐带间充质干细胞的基因表达特征和应用潜能。我们建立了人脐血间充质干细胞(CBMSCs)的分离培养体系,通过与脐带间充质干细胞的深入比较我们发现,mi RNA的调控特征显示脐带间充质干细胞的衰老主要受分化基因失调的影响,而泛素化依赖的蛋白降解过程对脐血间充质干细胞的衰老起了关键作用。对mi RNA表达谱和转录组的比较分析我们发现脐带和脐血间充质干细胞在代谢、黏附、增殖和免疫调节等方面显著的功能差异。最后我们还利用细胞因子抗体芯片对两种细胞的条件培养液中55种细胞因子的含量进行了检测。通过这些分析我们发现与脐带来源相比,脐血来源的间充质干细胞在神经、血管和胰岛等组织修复、造血干细胞支持以及免疫调节等方面表现出更突出的应用潜能。4.研究了脐血间充质干细胞分泌组分的抗衰老作用。我们首先证明了脐血间充质干细胞分泌组分能够显著降低由过氧化氢诱导的活性氧水平上升,减缓了细胞的衰老。然后以12个月自然衰老的小鼠为模型,我们分析了脐血间充质干细胞分泌组分对小鼠的影响。通过对小鼠外周血淋巴细胞中T、B、髓细胞亚群、NK细胞亚群、调节性T细胞、原始和记忆T细胞亚群的表征分析我们发现与对照组相比间充质干细胞的分泌组分能够显著改善衰老小鼠的免疫调节功能。进一步的组织切片分析显示间充质干细胞的分泌组分也显著改善了小鼠皮肤和肾脏组织的衰老情况。这些结果显示脐血间充质干细胞分泌组分能够抑制活性氧引起的细胞衰老、调节机体免疫功能,改善机体组织的衰老情况,减缓衰老。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

图 1. 1 干细胞自我更新、衰老和癌变的相互关系[80]A 对干细胞衰老和自我更新的作用A（miRNA）是一类长度在 22 个碱基左右的细胞内源性的非个 miRNA lin-4 在线虫中被首次鉴定出来，由此揭示出细胞中这一重要的机制[82]。miRNA 基因广泛分布于动物、植物、新的 miRNA 数据库 miRBase 中包含了 471 个黑腹果蝇 miRmiRNA 以及 2693 个人类 miRNA 的信息[83, 84]。许多 miRNA 现出高度的保守性。据研究，在人类细胞中有超过 60%的蛋保守的 miRNA 结合位点，而考虑到还有大量的非保守位点分的蛋白编码基因都受到 miRNA 的调控[85]。因此，癌症、 miRNA 表达失调有直接的联系[86]。

图 1. 2 miRNA 的经典合成过程[88]A 的调控机制后转录水平上，miRNA 对 mRNA 的调控主要通过三种方式：剪切作用、进 mRNA 衰减。 miRNA 与靶向的 mRNA 以近似碱基完全互补的方式结合时，同时协同aute 蛋白具有核苷酸的剪切催化活性时，miRNA 可以通过类似 RNA 干扰的转录本进行直接的剪切作用[94]。这种 miRNA 的剪切模式在植物中较为类及其它哺乳动物中目前仅发现个别 mRNA 转录本受 miRNA 的直接剪5]。更为普遍的方式是 miRNA 通过碱基部分匹配的方式识别靶点 mRNA，A 中有 2-8 个碱基长度的一段区域对 miRNA 与 mRNA 的识别起关键作用称为种子区域（seed region）。通过这种方式 miRNA 实现对靶基因表达的

第一章 绪论示，在这些临床试验中，针对心血管疾病的治疗占到了 109 项（13.6的治疗占到了 70 项（8.76%），针对 2 型糖尿病的治疗占到了 13 项对衰老相关的神经退行性疾病（阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿病症）的治疗占到了 38 项（4.76%）。这些研究显示出了间充质干细胞衰老相关疾病中巨大的临床应用潜能。

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本文编号：2830044