白藜芦醇对D—半乳糖急性致衰小鼠胸腺的保护机制

发布时间：2020-10-11 04:39

　　 研究背景和目的目前,世界各国人口趋于老龄化,免疫机能退化是导致机体衰老的一个重要因素。抑制免疫器官的衰老已成为主要的医学课题。胸腺是重要的中枢免疫器官,由胸腺细胞和胸腺基质细胞组成,为初始T细胞发育和成熟提供特殊的微环境,胸腺微环境主要由胸腺基质细胞,细胞外基质等组成,其中胸腺上皮细胞(Thymic epithelial cells,TECs)是胸腺微环境最重要的组成部分,对T细胞的分化、选择性发育至关重要。胸腺随着年龄的增长会出现增龄性萎缩,主要表现为胸腺体积缩小,T细胞输出下降,TECs减少,脂肪细胞增加等。D-半乳糖(D-galactose,D-gal)可加速小鼠老化,导致神经衰退,免疫功能退化,生殖功能退化等。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)已被证明具有免疫调节作用,但RSV是否影响胸腺微环境和预防胸腺退化仍不清楚。转录因子叉头蛋白N1(Forkhead box protein N1,FoxN1)调控TECs的分化和增殖,免疫调节因子(Autoimmune regulator,Aire)调控髓质胸腺上皮细胞的发育和成熟,但RSV对FoxN1和Aire功能的影响仍未可知。因此,本研究主要探索RSV对D-gal引起的的胸腺急性退化是否有保护作用,以及RSV是否通过调节Aire和FoxN1发挥作用,最终期望为探索胸腺退化机制和RSV改善胸腺功能提供理论基础和依据。方法1.ICR小鼠(2月龄)50只随机分为五组,每组10只:对照组、D-gal组、RSV三个剂量组(25、50、100mg/kg.d)。腹腔注射8周D-gal(120mg/kg.d)建立小鼠急速衰老模型,两周后灌胃不同剂量的RSV。取材3h前腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)(120mg/kg),取胸腺组织。2.胸腺组织进行石蜡和冰冻切片,以及DNA、RNA的提取。3.流式细胞术:分离胸腺细胞,观察胸腺细胞亚群(CD4~+,CD8~+)的变化(n=4)。4.衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidas,SA-β-Gal)染色观察胸腺中细胞衰老的情况(n=3)。5.脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUT缺口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP nick end labeling,Tunel)染色:观察胸腺中细胞凋亡的情况(n=4)。6.HE染色和免疫组织化学:观察胸腺形态变化和BrdU,Aire,FoxN1的表达(n=4)。7.qRT-PCR:检测Aire,FoxN1的mRNA表达。8.甲基化检测:亚硫酸氢盐处理DNA,甲基化特异性PCR检测Aire,FoxN1基因启动子区甲基化的情况;亚硫酸氢盐修饰后PCR测序检测Aire基因启动子区CpG位点的甲基化情况。结果1.D-gal组与对照组相比:(1)胸腺组织萎缩:胸腺体积缩小,皮髓质分界不清。(2)增殖的细胞减少,衰老和凋亡的细胞增加。(3)Aire,FoxN1蛋白表达下降,mRNA表达降低。(4)Aire,FoxN1基因启动子区甲基化水平增加,未甲基化水平降低;Aire基因启动子区甲基化的CpG位点增加。2.RSV给予后:(1)胸腺体积增加,皮髓质分界清晰。(2)增殖的细胞增加,衰老和凋亡的细胞减少。(3)Aire,FoxN1蛋白表达升高,mRNA表达增加。(4)Aire,FoxN1基因启动子区甲基化水平降低,未甲基化水平升高。结论1.D-半乳糖引起胸腺结构改变,降低Aire,FoxN1的表达。2.白藜芦醇对D-半乳糖导致的胸腺损伤有保护作用;可能通过促进Aire和FoxN1的表达改善胸腺功能。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

结果1 白藜芦醇减缓胸腺萎缩.1 白藜芦醇增加胸腺指数D-gal 处理之后，小鼠胸腺体积明显小于对照组（图 1A），小鼠的胸腺指数=胸腺重量 mg/小鼠体重 g）降低（图 1B），两组雄性小鼠的差异具有统计学意义（P<0.05），而灌胃 RSV 之后，与 D-gal 组相积恢复，胸腺指数也有所增加，但差异没有统计学意义（P>0.05）。小鼠雌雄各 4 只，结果可知小鼠的雌雄差异对胸腺指数影响较大（P组雌性小鼠的胸腺指数均大于该组雄鼠的胸腺指数（图 1C）。

1.2 白藜芦醇加强胸腺皮髓质区域化为了阐明 RSV 补充后小鼠胸腺的结构的改变，本实验通过 HE 染色的方法对各组胸腺样本进行观察。结果如图 2 所示，D-gal 组的胸腺皮层和髓质之间的确定区域变得模糊，皮髓质分界不清晰，RSV 补充之后小鼠胸腺皮髓质分界清晰，胸腺皮质增厚。说明 D-gal 可以使胸腺区域化降低，RSV 摄入改善了胸腺萎缩或退化。

22图 4 小鼠胸腺中 BrdU 标记结果。A：BrdU 标记的免疫组织化学结果。棕色代表 BrdU 阳性细胞，蓝色代表苏木精复染的细胞核。Scale bar:200um, 100um, 20um。B：BrdU 阳性细胞统计结果。D-gal 组小鼠胸腺中 BrdU 阳性细胞明显降低，RSV 组胸腺中 BrdU 阳性细胞增加。
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本文编号：2836080