铜绿假单胞菌中PprB调节系统对碳源张力的响应研究

发布时间：2020-10-11 05:06

　　 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种在自然界中广泛存在的条件性致病菌,能导致多种人体细菌感染疾病,特别是在一些免疫功能低下的个体中发现的囊性纤维化感染。这类细菌感染常因为生物被膜的形成而难以治愈。在之前的研究中发现,PprA-PprB双组分系统(TCS)调控的ⅣVb-Tad菌毛,BapA粘附素和CupE菌毛等物质均与一种新型生物被膜的形成有关。已有的关于PprB蛋白在细菌中的生理功能研究主要是以过表达PprB菌株作为研究对象,发现过表达PprB菌株与野生型菌株相比细胞膜通透性和氨基糖苷类药物敏感性上升,而细菌毒力减弱,并且更有利于强健生物被膜的形成。同时,PprB突变菌株的表型研究中也发现此菌株形成生物被膜的能力减弱。然而,在野生型菌株中触发PprA-PprB双组分系统响应的环境信号仍不明确,关于PprB介导生物被膜形成的分子机制的研究结果也比较少。明确触发细菌内部的调节系统的外部环境信号,对于理解细菌的调节系统的信号通路以及相关的功能研究至关重要。在本论文的研究中,我们发现低碳张力是诱导PprB及其调节基因的转录上调的外部环境信号,并且确定了 PprB的低碳张力响应是因为受到了响应一般环境张力的σ因子RpoS的调控,而非双组分调节系统的PprA。同时我们还观察到PprB对其自身转录的抑制作用,并发现在铜绿假单胞菌中PprB过表达极大地增强了细菌-细菌间和细菌-表面间的粘附能力。这种高强度粘附能力的形成与BapA粘附素和CupE菌毛的表达有很大的关系,而与Ⅳb-Tad菌毛关系不大。此外,PprB调节的基因在菌落生物膜生长3天时转录水平上升,表明此时的生物被膜可能处于低碳状态。本论文确立了一种“低碳张力-RpoS-PprB-BapA/Flp/CupE”的生物被膜形成的新途径,为今后对生物被膜形成的理解提供了新的视角。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R378
【部分图文】：

?第一章绪论???一般来讲生物被膜是被胞外ＥＰＳ?（水合聚合物基质）包裹的不可逆粘附于表??面的细菌聚集体。ＥＰＳ的主要组成元素有蛋白质，核酸以及多糖＃］。细菌被ＥＰＳ??包裹并因为胞外聚合物基质之间的相互作用而形成能够抵抗外界环境张力的生??物被膜。不同环境，不同菌种形成的生物被膜都会具有很大形态差异。??目前对生物被膜形成的研宄很多［１９－２１］，但仍未确定生物被膜的具体形成机制。??＊?—

Ｆｌｐ（ｆｉｍｂｒｉａｌｌｏｗ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白是?Ｔａｄ?菌毛的基本结构单兀，??ＰＡ４２９５编码的ＦｐｐＡ蛋白是一种天冬氨酸蛋白酶，主要负责控制Ｆｌｐ菌毛的成??熟［７ｎ，Ｔａｄ菌毛的组成的可能结构如图１．３所示。??７??

??２．１．１焚光报告质粒的构建??本实验采用的荧光报告质粒，如图２．１所示：我们使用绿色焚光蛋白Ｓｆｇｆｐ作??为荧光报告质粒的报告基因，用目标启动子作为Ｓｆｇｆｐ荧光蛋白的启动子，所以??细菌中ＳｆｇＱ）的荧光强度的大小可以用来衡量目标基因的转录水平，使用ＲＢＳｎ??作为结合能力很强的核糖体结合位点。为了消除翻译调控对目标基因的启动子转??录的影响，我们在启动子与Ｓｆｇｆｊｓ荧光报告基因之间加入了?ＲＮＡｓｅｌｌｌ位点，使??焚光报告基因?＜妨）在转录为ｍＲＮＡ之后与启动子的其余部分切割开，以免目标??启动子序列上的翻译相关的调控区域影响转录水平。我们构建的荧光报告质粒将??目标基因的启动子区域，ｒｂｓ区域和编码区前的几十个碱基连接在一起至于??ＲＮＡＩＩＩ序列前方位置，启动子区域一般延伸到ｌＯＯＯｂｐ左右以包含整个基因的转??录调控区域，但截止在上一个基因的启动子之前。在荧光报告质粒上还包括以强??启动子Ｊ２３１０２启动的Ｃｙｏｆｐ荧光蛋白基因作为内标荧光蛋白
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本文编号：2836111