成纤维细胞生长因子14表达及神经保护作用研究
发布时间：2020-10-19 16:27
成纤维细胞生长因子14为FGF家族成员之一,主要表达于中枢神经,其基因突变与神经系统异常疾病紧密相关,但目前关于FGF14与相关疾病及其作用机制方面的研究尚处于起始阶段。因此,本研究通过基因工程技术克隆FGF14基因片段、构建工程菌株及在大肠杆菌中的表达、纯化工艺研究,并研究FGF14蛋白对NIH3T3、PC12细胞促增殖活性及对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞建立阿尔兹海默症模型的神经保护作用。本课题的研究结果如下:FGF14基因片段与pET15b表达载体连接形成重组质粒,转化到感受态BL21(DE3)中,将重组FGF14蛋白在大肠杆菌表达体系中高密度表达。通过超声破碎方法破碎菌体使目的蛋白释放,经SDS-PAGE方法验证得出FGF14蛋白大部分以包涵体形式表达。通过包涵体清洗、盐酸胍变性,采用稀释复性方法使蛋白恢复其正常的空间结构,再通过表达载体具有组氨酸标签与镍柱特异性亲和特性进行纯化获得较高纯度FGF14蛋白。表达纯化工程化技术的建立为FGF14蛋白应用和机制研究提供了保障。选择NIH3T3、PC12细胞利用CCK8的方法检测FGF14蛋白促增殖生物学活性。经检测发现在无肝素存在条件下FGF14蛋白对NIH3T3、PC12细胞促增殖活性不明显或无促增殖活性,而FGF14在与一定浓度肝素结合的条件下在PC12细胞中具有了明显的促增殖活性。活性检测方法的建立为FGF14蛋白的定性和定量提供了重要依据。利用Aβ_(25-35)损伤PC12细胞研究FGF14蛋白对神经保护作用。采用Aβ_(25-35)损伤浓度为40μmol/L、作用时间为48 h,成功构建神经损伤模型;通过剂量摸索发现FGF14蛋白在4~16 ng/mL浓度范围内,减轻Aβ_(25-35)导致的神经损伤呈现出剂量依赖性,同时在该浓度范围内能够显著抑制LDH、MDA的释放,证明FGF14蛋白对PC12细胞具有神经保护作用。利用荧光以及流式的技术方法同样证明FGF14蛋白具有较好的神经保护作用。进一步,利用Western Blot技术证明FGF14蛋白是通过MAPK信号通路发挥神经保护作用。
【学位单位】：温州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q42;R336
【部分图文】：
第三章 结果和分析GF 家族中一员，对于 FGF 各成员的作用是研究杆菌体系中进行表达、纯化，并检测 FGF14 的鉴定及序列分析C-hFGF14 质粒和 pET-15b 载体通过 Nde I 和14 以及载体 pET-15b 片段，在连接酶作用下以感受态 E. Coli DH5α 感受态细胞中，随机挑取相质粒，该质粒经 Nde I 和 BamH I 双酶切切出 Fp，载体 pET-15b 片段大小约为 5700bp，与预准确插入到表达载体 pET-15b 中。将筛选出的果与设计预期完全相同，基因、氨基酸、载体
白表达及条件优化组质粒转入到表达载体 BL21(DE3)中，通过小锥形瓶的表达实验将 以 1 mmol/L 的终浓度在 37 ℃下诱导 4 h，收集样品在 12%中进行分析。结果显示如图 3-2a，1 为诱导前电泳条带，2~6 分别导后电泳条带，诱导后和诱导前相比有明显的蛋白表达条带。通过析，利用 hFGF14 单克隆抗体鉴定出诱导蛋白为 hFGF14 如图 3-2b。选出的高表达菌株作为菌种，将高表达菌株的菌种在 2 L 的大三大培养，优化发酵培养基、培养温度为一代种子培养条件是 37 ℃，至 A600值达到 0.8~1.0；二代种子培养条件为 37 ℃，180 rpm 培养值达到3~5时转至2 L大摇瓶中扩大培养，待菌液A600值为0.8~1.0剂 IPTG 终浓度为 1 mmol/L。温度为 32 ℃，180 rpm 培养 4 h，加间隔 1 h 分别取样，如图 3-2c 结果显示在 2 L 大摇瓶扩大培养成功 蛋白。温度为 18 ℃，180 rpm 培养 24 h，加入诱导剂后每间隔 8 h图 3-2d 结果显示在 2 L 大摇瓶扩大培养成功诱导出 FGF14 蛋白。
GF14 重组蛋白诱导表达的 12%(v/v) SDS-P~5：不同菌株经 IPTG 诱导后；M：蛋白质DS-PAGE analysis of FGF14 recombinant pron; Lane 2,3,4 and 5: induction FGF14 protein iogalactopyranoside (IPTG) ; lane M: molecu
【参考文献】
本文编号：2847442
【学位单位】：温州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q42;R336
【部分图文】：
第三章 结果和分析GF 家族中一员，对于 FGF 各成员的作用是研究杆菌体系中进行表达、纯化，并检测 FGF14 的鉴定及序列分析C-hFGF14 质粒和 pET-15b 载体通过 Nde I 和14 以及载体 pET-15b 片段，在连接酶作用下以感受态 E. Coli DH5α 感受态细胞中，随机挑取相质粒，该质粒经 Nde I 和 BamH I 双酶切切出 Fp，载体 pET-15b 片段大小约为 5700bp，与预准确插入到表达载体 pET-15b 中。将筛选出的果与设计预期完全相同，基因、氨基酸、载体
白表达及条件优化组质粒转入到表达载体 BL21(DE3)中，通过小锥形瓶的表达实验将 以 1 mmol/L 的终浓度在 37 ℃下诱导 4 h，收集样品在 12%中进行分析。结果显示如图 3-2a，1 为诱导前电泳条带，2~6 分别导后电泳条带，诱导后和诱导前相比有明显的蛋白表达条带。通过析，利用 hFGF14 单克隆抗体鉴定出诱导蛋白为 hFGF14 如图 3-2b。选出的高表达菌株作为菌种，将高表达菌株的菌种在 2 L 的大三大培养，优化发酵培养基、培养温度为一代种子培养条件是 37 ℃，至 A600值达到 0.8~1.0；二代种子培养条件为 37 ℃，180 rpm 培养值达到3~5时转至2 L大摇瓶中扩大培养，待菌液A600值为0.8~1.0剂 IPTG 终浓度为 1 mmol/L。温度为 32 ℃，180 rpm 培养 4 h，加间隔 1 h 分别取样，如图 3-2c 结果显示在 2 L 大摇瓶扩大培养成功 蛋白。温度为 18 ℃，180 rpm 培养 24 h，加入诱导剂后每间隔 8 h图 3-2d 结果显示在 2 L 大摇瓶扩大培养成功诱导出 FGF14 蛋白。
GF14 重组蛋白诱导表达的 12%(v/v) SDS-P~5：不同菌株经 IPTG 诱导后；M：蛋白质DS-PAGE analysis of FGF14 recombinant pron; Lane 2,3,4 and 5: induction FGF14 protein iogalactopyranoside (IPTG) ; lane M: molecu
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 范翠英;冯利兴;樊金玲;果德安;刘璇;;重组蛋白表达系统的研究进展[J];生物技术;2012年02期
2 吕微;蒋剑春;徐俊明;;蛋白质提取及分离纯化研究进展[J];精细石油化工进展;2010年11期
3 解庭波;;大肠杆菌表达系统的研究进展[J];长江大学学报(自科版)医学卷;2008年03期
本文编号：2847442
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