嵌合型轮状病毒与肠道病毒71型病毒样颗粒在杆状病毒表达系统中的表达与组装

发布时间：2020-10-26 11:27

　　 感染性腹泻与手足口病是婴幼儿常见疾病,这两种疾病一直占据我国丙类传染病发病人数前两位,不但严重威胁着婴幼儿的健康及生存质量,而且每年需要消耗大量的医疗卫生资源,给家庭及社会带来庞大的经济负担。据研究表明,60%的5岁以下婴幼儿感染性腹泻是由A组轮状病毒(Rotavirus,RV)感染引起的,手足口病则多由肠道病毒71型(EV71)感染引起。市场上目前尚无针对轮状病毒及EV71型感染的特效药物,接种相应疫苗仍然是预防其感染的最有效方式。因此,发展能同时预防这两种病毒感染的双价疫苗十分必要。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗因其缺乏核酸基因组和具有完全免疫原性正成为高效安全的新一代候选疫苗。本实验室在前期已经通过同时表达轮状病毒的衣壳蛋白VP2、VP6和VP7成功构建了轮状病毒样颗粒,其稳定性和真实病毒粒子相似,但是其诱导免疫反应的水平还有待于进一步提高。研究发现,VP4在轮状病毒入侵进入小肠上皮中起着关键作用,同时表达VP2、VP4、VP6和VP7的病毒样颗粒能够更加有效的进入小肠上皮细胞,提高黏膜免疫水平和系统免疫水平;此外,前期工作还表明,将全长EV71 VP1替换掉RV-VP2 N端的92个氨基酸后,融合蛋白依然能与VP6、VP7包装成病毒样颗粒。本研究首先通过PCR技术获得了EV71 VP1和RV VP2、VP4、VP6、VP7基因,并将EV71 VP1和截短的RV VP2进行融合得到ER1,2基因,将各个目的基因分别克隆至转移载体pYBDM-IM和pUCDM-XIGP,然后运用Multibac杆状病毒表达系统构建同时携带EV71 VP1和RV VP2、VP4、VP6、VP7的重组杆状病毒,转染Sf9昆虫细胞,观察到红色荧光和绿色荧光,并在细胞中成功表达了相关基因蛋白,利用Western Blot鉴定了蛋白的表达情况,利用蔗糖密度梯度离心的方法对蛋白进行纯化,并在透射电镜下观察VLPs的结构。结果显示ER1,2、VP2、VP4、VP6、VP7蛋白大小分别为127 KD、104 KD、88KD、46 KD、38 KD,蛋白条带较为单一且蛋白大小与预期一致,由此可见病毒样颗粒的相关基因已正确表达。通过该方法获得的VLPs并不是分别对肠道病毒样颗粒和轮状病毒样颗粒的制备和纯化,再将二者混合,而是制备了嵌合型的双价病毒样颗粒,充分发挥了杆状病毒多基因表达系统优势,减少生产成本,提高生产效率。本研究充分利用轮状病毒样颗粒的纳米特性及其VP2基因能够携带较大外源蛋白的特点,将引起手足口病毒重症的肠道病毒EV71的主要抗原VP1与截短后的轮状病毒衣壳蛋白VP2融合,同时将RV VP4基因展示在中间层,将RV VP4、VP7基因展示在外层,获得嵌合型双价病毒样颗粒,为制备同时抗手足口病毒和轮状病毒腹泻的双价疫苗奠定了前期的实验基础。该研究思路和方法能够更进一步拓展病毒样颗粒疫苗的设计思路,对构建其他多价病毒样颗粒疫苗具有借鉴意义,为获得能同时抗手足口病和轮状病毒感染性腹泻的双价病毒样颗粒疫苗打下基础。
【学位单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373
【部分图文】：

大利亚学者 Bishop 等最早在腹泻病人的十二指肠中发现了一人类轮状病毒[6]。毒粒子在电子显微镜下呈球状，没有被膜[7,8]，为二十面体对密六角型核心，即为芯髓。完整的轮状病毒颗粒直径约 70 nm包绕，其中结构蛋白 VP1、VP2、VP3 基因构成内层衣壳，V，VP4、VP7 基因构成外层衣壳。因组是由 11 个分节段的双链 RNA 片段组成，其中第 11 基因 NSP6 两个蛋白，其他基因片段分别编码一个蛋白，分别是 V构蛋白和 NSP1~4、NSP5、NSP6 六个非结构蛋白[9-11]。VP6清群分类的重要依据，根据其抗原性的不同，可分为 A~ G 七以 A 群轮状病毒危害最为严重，几乎每个儿童在 5 岁以前都也是全世界研究学者最为关注的[12-14]。

不同的病毒流行株引起的临床症状也不尽相同，EV不同国家和不同年份中也不一致，目前尚不能清楚了解病毒基间的关系，也缺乏可用于致病机理与疫苗评价的动物模型，这要课题。 基因组的全长为 7500 bp 左右，仅有一个开放阅读框（open re表达一个约 2200 个氨基酸的多聚蛋白。ORF 是由一个结构蛋 P2 和 P3 区域组成。结构蛋白 P1 编码的结构蛋白（VP1~VP非结构蛋白 P2 和 P3 编码的多肽蛋白负责病毒的复制[41]。研EV71 中只有一个普遍中和的抗原决定基，即 VP1 上的一个线区域是主要的中和决定因子，因此 EV71 病毒衣壳蛋白 VP1 区性，被作为人肠道病毒属血清型分类的依据，成为 EV71 基因重要对象[42]。

南阳师范学院硕士学位论文筛选和划线验证的方法得到阳性菌液，再以该菌液为菌株制备 Am 感受态细胞，最后将 pFBDMΔspeI-IM-ph-VP7-p10-VP4 导入其中。由于 pFBDM 载体的转座效率高于pUCDM 的转座效率，因此本实验采用了第一种策略，成功获得了重组杆状病毒BV-RV2/4/6/7 和 BV-ER1,2-RV4/6/7 的阳性菌液。构建的重组杆状病毒携带多个外源基因的表达盒示意图见图 2-1。
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本文编号：2856938