贵州省中华按蚊抗药性靶标kdr、ace-1基因突变检测及种群遗传学研究

发布时间：2020-11-05 17:02

　　 目的:了解贵州省不同地区中华按蚊(Anopheles sinensis)抗药性靶标基因突变情况,分析中华按蚊种群遗传多样性、遗传分化和种群扩张情况及系统发育关系,为贵州省中华按蚊抗药性机制研究及其防制提供基础数据和科学指导。方法:采用灯诱法在贵州省不同地区稻田周边采集成蚊,挑选经形态学鉴定的中华按蚊雌蚊,用WHO推荐的接触筒法测定中华按蚊成蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性情况,然后提取基因组DNA扩增mtDNA-COI基因进行蚊种的分子鉴定;对确认为中华按蚊的DNA样本PCR扩增kdr、ace-1基因并测序,运用DNAStar软件对测序结果进行拼接和比对,检测kdr基因1014位点和ace-1基因119位点的突变情况,计算相关基因频率和基因型频率;使用DNASP5.0软件分析mtDNA-COI基因的多态性,计算种群分化系数和基因流大小,并进行中性检验和错配分析;使用MEGA7.1软件计算各种群间的遗传距离,并分析其与地理距离的相关性,基于种群遗传距离构建种群系统发育进化树。结果:贵州省中华按蚊接触杀虫剂药膜1 h后,击倒率在34.31%~86.21%之间,24 h的死亡率在37.93%~89.74%之间;经形态学和分子鉴定,12个种群共获得中华按蚊样本551只,经PCR扩增、测序拼接和比对,得到kdr、ace-1和mtDNA-COI基因序列各551条,其中kdr基因1014位点检测到5种等位基因,分别为1014L(70.50%)、1014F(24.44%)、1014C(0.63%)、1014S(2.17%)和1014W(2.26%),各种群突变基因频率在2.00%~57.69%之间,共发现18种基因型,基因型频率在0.18%~56.48%之间;ace-1基因119位点检测到2种等位基因,分别为119G(49.64%)和119S(50.36%),突变基因频率在6.00%~77.00%之间,共发现5种基因型,基因型频率在0.18%~38.47%之间。551条mtDNA-COI基因序列中共检出329种单倍型,占总样本数的百分比为59.71%,各种群单倍型占其样本数的百分比在70%以上,单倍型多样性指数在0.99以上,核苷酸多样性在0.015以上,12个种群的Fst值在0.0008~0.4207之间,Nm值在0.0861~75.239之间,中性检验统计值均为负值,大部分种群错配分析的歧点分布曲线呈单峰,种群内遗传距离范围在0.0071~0.0529之间,种群间的遗传距离范围在0.0079~0.0522之间,遗传距离与地理距离之间的决定系数R~2=0.1658,两者间有一定的正相关关系,都匀、织金种群系统发育进化树中较其他种群相对独立。结论:贵州省中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了一定程度的抗药性,kdr基因1014位点存在4种基因突变,基因突变频率较低,突变基因以L1014F为主;贵州省中华按蚊ace-1基因119位点发生G119S突变的频率较高且分布广泛,有一定抗药性风险;贵州省中华按蚊种群遗传多样性较高,大部分种群之间遗传分化较小,基因交流比较丰富,在历史上经历了种群扩张,存在一定的地理隔离,呈现出交流与隔离并存的分布格局。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R384.1
【部分图文】：

图 1-1 贵州省中华按蚊野外种群采集点分布图Fig. 1-1 Sampling sites of field-population of Anopheles sinensis in Guizhou表 1-3 贵州省中华按蚊野外种群采集点信息Table 1-3 Collection information of field-population of Anopheles sinensis in Guizhou集地点ection sites经纬度Longitude andlatitude海拔高度Altitude采集点生境情况Habitat conditions at collection sites采集时间Collectiontime种Po市平坝县 26.554 N，106.341 E 1253 m 牛圈、猪圈灯诱，周边有稻田 2017.07 平州册亨县 24.994 N，105.771 E 706 m 牛圈、猪圈灯诱，周边有大片稻田 2017.08 册州罗甸县 25.226 N，106.682 E 389 m 牛圈、猪圈灯诱，周边有稻田 2017.08 罗市花溪区 26.399 N，106.591 E 1170 m 牛圈、猪圈灯诱，周边有稻田 2018.07 花市织金县 26.694 N，105.835 E 1270 m 牛圈灯诱，周边有稻田 2018.07 织州黎平县 26.202 N，108.951 E 594 m 牛圈、猪圈灯诱，周边有稻田 2018.07 黎

图 2-1 中华按蚊 mtDNA-COI 基因电泳结果Fig. 2-1 The results of electrophoresis of mtDNA-COI gene in Anop2.3 中华按蚊 kdr 基因 1014 位点突变检测结果2.3.1 中华按蚊 kdr 基因 PCR 扩增及电泳检测将分子鉴定为中华按蚊的 DNA 样本用特异性 kdr 引物( kdr-F 扩增 kdr 基因，PCR 产物经电泳成像后显示在 DL2000 DNA Mark500 bp 条带之间有明显单一条带。（图 2-2）图 2-2 中华按蚊 kdr 基因电泳结果

图 2-1 中华按蚊 mtDNA-COI 基因电泳结果Fig. 2-1 The results of electrophoresis of mtDNA-COI gene in Anopheles 2.3 中华按蚊 kdr 基因 1014 位点突变检测结果2.3.1 中华按蚊 kdr 基因 PCR 扩增及电泳检测将分子鉴定为中华按蚊的 DNA 样本用特异性 kdr 引物( kdr-F 和 kd扩增 kdr 基因，PCR 产物经电泳成像后显示在 DL2000 DNA Marker 的500 bp 条带之间有明显单一条带。（图 2-2）M：D1-22：
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本文编号：2871929