稳定表达siat7e基因的MDCK细胞的构建及其功能研究

发布时间：2020-11-05 17:19

　　 传统流感疫苗采用鸡胚作为病毒培养基质,生产周期长、操作繁琐、培养的病毒易突变。细胞基质培养的流感疫苗免疫原性更接近原始病毒,有望替代鸡胚成为新型流感疫苗生产基质。临床试验发现,MDCK细胞生产的流感疫苗在安全性和耐受性方面均优于鸡胚疫苗,但MDCK细胞具有贴壁依赖性,不利于大规模生产,且细胞培养过程中需要的血清具有批次不稳定、成分不清晰等缺点,使用能在无血清培养基中增殖的悬浮细胞生产生物制品是未来的总体趋势。研究表明,siat7e基因可有效降低细胞贴壁性能,本研究采用基因工程技术构建了稳定表达siat7e基因的MDCK单克隆细胞,并在无血清培养基中驯化为悬浮的单细胞MDCK-5G7-S,H3N2疫苗株在该细胞中增殖明显高于贴壁细胞,为悬浮MDCK细胞用于大规模流感疫苗生产奠定基础。在第一部分中,获得了稳定表达siat7e基因的MDCK细胞。首先构建表达载体pcDNA3.1-siat7e/Zeocin,通过电转将其转入MDCK细胞,利用博来霉素抗性筛选结合有限稀释法得到单克隆细胞。然后通过RT-PCR和WB方法分别从mRNA水平和蛋白水平鉴定siat7e基因表达情况,并通过qRT-PCR方法分析siat7e基因相对表达量,得到稳定高表达siat7e基因的MDCK-5G7细胞。在第二部分中,对MDCK-5G7细胞进行悬浮驯化并进行功能研究。首先对OptiPRO SFM、FreeStyle 293、CD293和VirusPro MDCK-S 4种无血清培养基进行筛选,选择可使MDCK-5G7细胞迅速适应的VirusPro MDCK-S培养基进行悬浮驯化,获得在VirusPro MDCK-S无血清培养基中悬浮生长的细胞MDCK-5G7-S。对细胞起始接种密度进行优化,确定最佳接种密度为1×10~6cells/mL,96h达到最高细胞密度2.45×10~6 cells/mL,存活率维持在80%以上。选择疫苗株A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)按感染复数为0.1分别接种贴壁MDCK、贴壁MDCK-5G7、悬浮MDCK-S和悬浮MDCK-5G7-S细胞,收集12h、24h、48h、72h和96h的病毒并测定CCID_(50)滴度,绘制病毒生长曲线,发现病毒在4种培养基中增殖趋势一致。比较48h病毒滴度,悬浮细胞的病毒产量均高于贴壁细胞,siat7e基因的转入进一步提高了病毒滴度,其中MDCK-5G7-S病毒滴度CCID_(50)可达10~(7.9)/mL,为流感病毒研究提供新的思路。
【学位单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

苗最理想的细胞基质。MDCK 细胞悬浮培养可以提高细胞密度和抗原短时间内快速生产大量流感疫苗，降低生产成本。目前多项研究表明 sia以降低 MDCK 细胞的贴壁依赖程度，使驯化过程更为方便快捷。了获得可悬浮生长的 MDCK 细胞，本研究通过电转将构建的 pcDNA3/Zeocin 质粒转入 MDCK 细胞，通过抗生素筛选结合有限稀释法得到稳siat7e 基因的阳性克隆。经逆转录 PCR 和蛋白免疫印迹方法分别从转录白质表达水平验证 siat7e 基因表达情况，为下一步悬浮驯化奠定基础。验材料体、菌株和细胞体：pcDNA3.1/Zeocin 真核表达载体，购自 Invitrogen 公司，载体图谱；

中国食品药品检定研究院硕士学位论文载体 pcDNA3.1/Zeocin 连接，转化大肠杆菌 DH5α。 经酶A3.1-siat7e/Zeocin 载体。图 1.2 显示泳道 2、4、6 均可在观察到线性化载体和 siat7e 基因片段，符合预期。将酶切阳显示 siat7e 基因序列与 GenBank 数据库序列相符（测序

图 1.3 MDCK 细胞在不同浓度博来霉素作用下的生存曲线 细胞电转 pcDNA3.1-siat7e/Zeocin 质粒后，通过电转仪器 GenePuls据相似细胞系非洲绿猴肾细胞（Vero）的电转条件，选择指、4.0×106cells/pulse 条件进行转染。本研究使用 pcDNA3.1照进行电转，筛选指数波电转时电压和电容条件。电压条件筛选ro 细胞电转条件，设置电容为 350μF，探索 MDCK 细胞在0V、300V、350 和 400V 时的电转效果。结果如图 1.4 所示虽然细胞存活率最高，贴壁细胞最多，但是成功表达 EGF压为 250V 时，成功转入 EGFP 质粒并发出荧光的细胞最
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本文编号：2871946