α7nAChR基因敲除HIV-1gp120转基因小鼠模型的构建
发布时间：2020-12-04 10:31
目的通过构建双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）,为探索α7乙酰胆碱受体（α7 nAChR）介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法α7 nAChR基因敲除小鼠（α7R-/-）与HIV-1 gp120转基因小鼠（gp120+）杂交（F0）,从产生的F1小鼠中,选取基因型为α7R+/-/gp120+的小鼠进一步交配,得到F2小鼠。PCR法鉴定和筛选F3小鼠基因型,免疫组化分析双转基因动物模型蛋白表达;体外实验使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制剂处理小胶质细胞,ELISA检测各组IL-1β与TNF-α表达情况。结果F3小鼠的PCR结果符合预期,其中有2只双基因编辑成功的小鼠。免疫组化结果显示双基因编辑小鼠（α7R-/-/gp120+）的脑组织缺乏α7 nAChR的同时高表达gp120蛋白。体外实验结果表明Gp120可促进小胶质细胞分泌IL-1β与TNF-α,而抑制α7nAChR后IL-1β与TNF-α表达明显降低（P<0.001）。结论α7R-/-/gp120+双基因修饰小鼠成功构建,且具有稳定遗传的特点,可为后续探索α7 nAChR介导gp120中...
【文章来源】：南方医科大学学报. 2020年08期 第1184-1191页 北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
图1 双基因编辑小鼠构建示意图
通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对F0小鼠进行基因型鉴定，结果显示，以α7nAChR敲除为亲本的雌性小鼠1～5号在187 bp处均有条带，提示基因型均为α7R-/-的纯合子；以gp120转基因为亲本的雄性小鼠Ⅰ～Ⅳ号在220 bp处均有条带，Ⅴ号小鼠在220 bp处无条带，表示Ⅰ～Ⅳ号基因型为gp120+，Ⅴ号小鼠基因型为gp120-（图2），剔除Ⅴ号，选取其余小鼠作为亲本。2.2 F1小鼠基因型鉴定
基因编辑技术、受精卵原核注射法和杂交繁殖技术是建立转基因动物模型常用的技术手段，最早建立且发展较成熟的转基因动物模型就是转基因小鼠，其繁殖方便，周期相对较短，成本低等一系列优点使得转基因小鼠模型的构建更加省时省力[19]。本次研究主要利用杂交繁殖技术构建了双基因修饰小鼠模型（α7R-/-/gp120+），通过基因检测证明α7nAChR基因敲除成功，且gp120显示过表达。分析F0到F2代小鼠的基因型可以看出，α7nAChR敲除基因和gp120转基因均能稳定遗传。进一步，免疫组化检测发现在小鼠脑组织中α7nAChR蛋白未表达，gp120蛋白高表达，从基因水平和蛋白表达水平上均证明双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）构建成功。为初步探索α7nAChR受体的功能，本研究使用α-银环蛇毒素荧光染料对野生型和α7nAChR敲除小鼠的脑组织进行了染色。结果提示α7nAChR可与α-银环蛇毒素结合，且进一步说明α7nAChR敲除成功，从α7nAChR结合功能方面对小鼠进行了鉴定。本次实验中使用的α7nAChR纯合敲除小鼠具有生存率高，无明显脑形态异常的特点。该模型小鼠是通过同源重组技术造成小鼠胚胎干细胞的7 kb基因片段缺失。该缺失片段包括了α7nAChR最后三个外显子（8～10个外显子），这些外显子负责编码α7nAChR第二跨膜结构域（MII），形成离子通道和第三、第四跨膜结构域[20]。且经实验证实该小鼠脑组织中缺乏高亲和力的α-银环蛇毒素结合位点。烟碱型乙酰胆碱受体在生物学、生理学和病理学等方面都发挥着重要作用，与感觉、认知、疼痛和递质释放等密切相关。α7nAChR是烟碱型胆碱能受体之一，能调控炎性反应细胞释放细胞因子[14-15,18]，与神经系统疾病如阿尔兹海默症[21-22]、帕金森病[23]、精神分裂症[24-25]以及与炎症反应有关的危重症[26]等多种疾病相关。目前认为α7nAChR的抗炎作用可通过核转录因子-κB和Janus活化激酶2信号传感器和转录激活子3两条细胞内信号通路实现[17,27]，也有研究证明激活α7nAChR可以增强单核/小胶质细胞的自噬[28]，从而抑制神经炎症。
【参考文献】：
期刊论文
[1]HIV-1包膜蛋白gp120在神经元损伤诱发认知障碍中的作用[J]. 万宇,杨伟军,龚泽龙,曾志节,张汉运,吕柯瑶,曹虹. 中华微生物学和免疫学杂志. 2020(01)
[2]α7nAChR和nNOS在Aβ诱导的认知障碍大鼠皮质及海马表达的时间和空间变化[J]. 王艳莉,刘丽霞,王少虎,祁文秀. 生理学报. 2016(06)
[3]后基因组时代转基因小鼠在生命科学中的研究进展[J]. 马微,赵伟,李丹,汪坤福,张鹏霞. 医学综述. 2011(09)
[4]α7-nAChR在海马星形胶质细胞上的表达[J]. 王妍,张忠义,王勇. 南方医科大学学报. 2007(05)
本文编号：2897442
【文章来源】：南方医科大学学报. 2020年08期 第1184-1191页 北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
图1 双基因编辑小鼠构建示意图
通过PCR和琼脂糖凝胶电泳对F0小鼠进行基因型鉴定，结果显示，以α7nAChR敲除为亲本的雌性小鼠1～5号在187 bp处均有条带，提示基因型均为α7R-/-的纯合子；以gp120转基因为亲本的雄性小鼠Ⅰ～Ⅳ号在220 bp处均有条带，Ⅴ号小鼠在220 bp处无条带，表示Ⅰ～Ⅳ号基因型为gp120+，Ⅴ号小鼠基因型为gp120-（图2），剔除Ⅴ号，选取其余小鼠作为亲本。2.2 F1小鼠基因型鉴定
基因编辑技术、受精卵原核注射法和杂交繁殖技术是建立转基因动物模型常用的技术手段，最早建立且发展较成熟的转基因动物模型就是转基因小鼠，其繁殖方便，周期相对较短，成本低等一系列优点使得转基因小鼠模型的构建更加省时省力[19]。本次研究主要利用杂交繁殖技术构建了双基因修饰小鼠模型（α7R-/-/gp120+），通过基因检测证明α7nAChR基因敲除成功，且gp120显示过表达。分析F0到F2代小鼠的基因型可以看出，α7nAChR敲除基因和gp120转基因均能稳定遗传。进一步，免疫组化检测发现在小鼠脑组织中α7nAChR蛋白未表达，gp120蛋白高表达，从基因水平和蛋白表达水平上均证明双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）构建成功。为初步探索α7nAChR受体的功能，本研究使用α-银环蛇毒素荧光染料对野生型和α7nAChR敲除小鼠的脑组织进行了染色。结果提示α7nAChR可与α-银环蛇毒素结合，且进一步说明α7nAChR敲除成功，从α7nAChR结合功能方面对小鼠进行了鉴定。本次实验中使用的α7nAChR纯合敲除小鼠具有生存率高，无明显脑形态异常的特点。该模型小鼠是通过同源重组技术造成小鼠胚胎干细胞的7 kb基因片段缺失。该缺失片段包括了α7nAChR最后三个外显子（8～10个外显子），这些外显子负责编码α7nAChR第二跨膜结构域（MII），形成离子通道和第三、第四跨膜结构域[20]。且经实验证实该小鼠脑组织中缺乏高亲和力的α-银环蛇毒素结合位点。烟碱型乙酰胆碱受体在生物学、生理学和病理学等方面都发挥着重要作用，与感觉、认知、疼痛和递质释放等密切相关。α7nAChR是烟碱型胆碱能受体之一，能调控炎性反应细胞释放细胞因子[14-15,18]，与神经系统疾病如阿尔兹海默症[21-22]、帕金森病[23]、精神分裂症[24-25]以及与炎症反应有关的危重症[26]等多种疾病相关。目前认为α7nAChR的抗炎作用可通过核转录因子-κB和Janus活化激酶2信号传感器和转录激活子3两条细胞内信号通路实现[17,27]，也有研究证明激活α7nAChR可以增强单核/小胶质细胞的自噬[28]，从而抑制神经炎症。
【参考文献】：
期刊论文
[1]HIV-1包膜蛋白gp120在神经元损伤诱发认知障碍中的作用[J]. 万宇,杨伟军,龚泽龙,曾志节,张汉运,吕柯瑶,曹虹. 中华微生物学和免疫学杂志. 2020(01)
[2]α7nAChR和nNOS在Aβ诱导的认知障碍大鼠皮质及海马表达的时间和空间变化[J]. 王艳莉,刘丽霞,王少虎,祁文秀. 生理学报. 2016(06)
[3]后基因组时代转基因小鼠在生命科学中的研究进展[J]. 马微,赵伟,李丹,汪坤福,张鹏霞. 医学综述. 2011(09)
[4]α7-nAChR在海马星形胶质细胞上的表达[J]. 王妍,张忠义,王勇. 南方医科大学学报. 2007(05)
本文编号：2897442
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/2897442.html
