O2血清型肺炎克雷伯氏菌多糖结合疫苗的生物合成
发布时间：2020-12-20 23:34
本研究旨在利用微生物体内合成肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)多糖结合疫苗并研究其保护效果。通过敲除Kp O抗原连接酶基因waaL阻断其LPS合成,再向缺失株中导入糖基工程载体,使细菌能够在体内合成糖蛋白,并将该糖蛋白免疫小鼠后评价其保护效果。结果表明,在构建的KpwaaL缺失株中导入糖基工程载体后,底物蛋白重组霍乱毒素B亚单位rCTB (Recombinant cholera toxin B subunit)能够被O糖化,从而得到糖蛋白;动物实验结果显示该疫苗能刺激小鼠产生较高的抗体效价,试验组小鼠攻毒后一周存活率可达75%。这种生物合成方法制备的多糖结合疫苗有望成为针对肺炎克雷伯氏菌的新型候选疫苗。
【文章来源】：生物工程学报. 2020年09期 北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
Kp355 waa L基因缺失株的构建及鉴定
通过对表达Kp355 O抗原糖蛋白工程菌的大量培养和发酵纯化，得到了纯度较高的糖蛋白。由于底物蛋白r CTB带有6个组氨酸标签，通过镍柱亲和层析进行第一步纯化，可用低浓度咪唑溶液A1洗脱杂蛋白，高浓度咪唑溶液B1洗脱目的蛋白；再根据目的蛋白与杂蛋白分子大小的差异将样品通过凝胶过滤层析进一步纯化，以尽可能地除去杂蛋白。图3A为将样品注射入分子排阻色谱柱后，OD280值随流经色谱柱缓冲液体积的变化，箭头所示为样品收集峰，约为上样后80 m L处。通过考马斯亮蓝染色检测糖蛋白样品(图3B)可以看出，纯化得到的C-OPSKp糖蛋白纯度较高，样品中几乎没有杂蛋白，说明镍柱亲和层析以及凝胶过滤层析两步足以去掉绝大多数杂蛋白。经计算每升LB培养基得到的糖蛋白中糖含量约为120μg左右。2.4 Kp355 LD50测定与疫苗保护效果评价
随后，我们通过糖蛋白疫苗刺激小鼠产生的抗体效价、抗体亚型效价以及攻毒后不同佐剂组小鼠一周存活率的差异，来探究该疫苗的保护效果[11]。如图4A–E所示，各组小鼠血清抗体效价以10为底做对数变换后的结果为纵坐标，横坐标为不同试验组以及PBS组，试验组的总体Ig G抗体效价均与PBS组差异明显，无佐剂组、角鲨烯佐剂组以及Poly(I:C)佐剂组的抗体效价均高于铝佐剂组；按照上述Kp355两倍半数致死剂量腹腔攻击小鼠，结果如图4F所示，同总体Ig G抗体效价测定结果一致，无佐剂组、角鲨烯佐剂组以及Poly(I:C)佐剂组小鼠的存活率均可达75%，与PBS组差异明显，表明本研究制备的糖蛋白疫苗能够保护小鼠免于Kp355致死剂量的攻击。图4 C-OPSKp的保护效果
本文编号：2928766
【文章来源】：生物工程学报. 2020年09期 北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
Kp355 waa L基因缺失株的构建及鉴定
通过对表达Kp355 O抗原糖蛋白工程菌的大量培养和发酵纯化，得到了纯度较高的糖蛋白。由于底物蛋白r CTB带有6个组氨酸标签，通过镍柱亲和层析进行第一步纯化，可用低浓度咪唑溶液A1洗脱杂蛋白，高浓度咪唑溶液B1洗脱目的蛋白；再根据目的蛋白与杂蛋白分子大小的差异将样品通过凝胶过滤层析进一步纯化，以尽可能地除去杂蛋白。图3A为将样品注射入分子排阻色谱柱后，OD280值随流经色谱柱缓冲液体积的变化，箭头所示为样品收集峰，约为上样后80 m L处。通过考马斯亮蓝染色检测糖蛋白样品(图3B)可以看出，纯化得到的C-OPSKp糖蛋白纯度较高，样品中几乎没有杂蛋白，说明镍柱亲和层析以及凝胶过滤层析两步足以去掉绝大多数杂蛋白。经计算每升LB培养基得到的糖蛋白中糖含量约为120μg左右。2.4 Kp355 LD50测定与疫苗保护效果评价
随后，我们通过糖蛋白疫苗刺激小鼠产生的抗体效价、抗体亚型效价以及攻毒后不同佐剂组小鼠一周存活率的差异，来探究该疫苗的保护效果[11]。如图4A–E所示，各组小鼠血清抗体效价以10为底做对数变换后的结果为纵坐标，横坐标为不同试验组以及PBS组，试验组的总体Ig G抗体效价均与PBS组差异明显，无佐剂组、角鲨烯佐剂组以及Poly(I:C)佐剂组的抗体效价均高于铝佐剂组；按照上述Kp355两倍半数致死剂量腹腔攻击小鼠，结果如图4F所示，同总体Ig G抗体效价测定结果一致，无佐剂组、角鲨烯佐剂组以及Poly(I:C)佐剂组小鼠的存活率均可达75%，与PBS组差异明显，表明本研究制备的糖蛋白疫苗能够保护小鼠免于Kp355致死剂量的攻击。图4 C-OPSKp的保护效果
本文编号：2928766
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