釉结在牙齿发育中作用的探究及iPS细胞向软骨方向诱导分化的体外研究

发布时间：2017-04-12 03:15

  本文关键词：釉结在牙齿发育中作用的探究及iPS细胞向软骨方向诱导分化的体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牙齿的发育是一个长期、复杂的连续过程，包括牙胚的发生(initiation)、牙胚形成(morphogenesis)、细胞分化(differentiation)、牙齿萌出(eruption)等几个阶段。釉结是牙胚发育进入帽状期和钟状期出现的暂时性的结构，在牙发育后期消失。釉结位于牙胚中央，研究表明，釉结是调节牙早期形态发生的信号中心。因此，本实验旨在探究釉结在牙齿发生发育过程中的重要作用，利用小鼠的牙胚上皮组织与牙胚间充质组织重组移植的方法证实釉结在牙齿形成大小以及牙尖数量上起着至关重要的作用，随后用原位杂交方法追踪釉结的位置。本实验分别将完整的牙胚上皮组织、去掉釉结部分的牙胚上皮组织釉结组织与牙胚间充质组织重组，进行小鼠肾包膜移植体内实验以及体外原位杂交实验，体内移植实验结果表明，缺少釉结的重组实验组形成牙齿的大小比其他实验组小以及牙尖数量明显少。体外原位杂交实验结果表明：即使去掉釉结的上皮部分，在随后的发育过程中也会再生出新的釉结。以上实验结果说明，釉结确实在牙齿发生发育过程中是必不可少的一个部分。 由于缺乏合适的种子细胞，在软骨缺损的临床治疗方面，尚未建立完全有效的技术方法。因此，，软骨组织工程开发新的种子细胞来源有着重要的科学意义。干细胞技术是当今再生医学研究领域最为前沿的科学，本课题以诱导多能性干细胞为种子来源，通过拟胚体途径，在体外诱导软骨形成。我们将体外诱导分化的组织块进行软骨的表征实验，通过QPCR、免疫蛋白印迹、体外免疫染色等实验方法证实我们诱导的组织块具备软骨的表征。最终结果表明该途径可以成功诱导出具有软骨特征的组织样品，从而初步解决了软骨研究的种子细胞问题，也进一步为软骨发生发育的研究以及软骨疾病的修复提供了一定的基础。
【关键词】：牙的发育 釉结 软骨 干细胞 分化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R333.1
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 第一章 绪论8-18
• 1.1 牙齿的发生发育及釉结的发生发育8-12
• 1.1.1 牙齿的发生发育8-9
• 1.1.2 釉结的发生发育9-10
• 1.1.3 釉结与牙齿发生发育现状研究10-12
• 1.2 多能干细胞的相关研究与应用12-13
• 1.3 多能干细胞向软骨方向分化13-16
• 1.3.1 软骨的发生发育13-14
• 1.3.2 软骨损伤退变及相关疾病的现状研究及治疗研究14-15
• 1.3.3 多能干细胞体外向软骨分化的相关研究15-16
• 1.4 目的与意义16
• 1.5 研究思路16-18
• 1.5.1 釉结在牙齿发生发育中的重要作用16-17
• 1.5.2 多能干细胞体外向软骨分化的相关研究17-18
• 第二章 釉结在牙齿发生发育中重要作用的探究18-30
• 2.1 实验动物与实验耗材18-19
• 2.1.1 实验动物18
• 2.1.2 实验器材18
• 2.1.3 实验试剂18-19
• 2.2 实验方法19-24
• 2.2.1 14.5 天牙胚的获取19
• 2.2.2 牙胚上皮与间充质的分离19-20
• 2.2.3 上皮组织与间充质组织的重组与体外培养20
• 2.2.4 肾包膜移植、移植后取样20-21
• 2.2.5 冰冻组织切片21
• 2.2.6 组织切片苏木素-伊红（HE）染色及显微镜下观察21
• 2.2.7 处理培养牙胚以及处理后牙胚的肾包膜移植21-22
• 2.2.8 组织原位杂交22-24
• 2.3 实验结果与讨论24-29
• 2.3.1 牙胚的分离形态观察及釉结的识别切割24-25
• 2.3.2 重组牙胚的移植结果25-26
• 2.3.3 重组后牙齿的染色形态观察26-27
• 2.3.4 体外培养不同组重组牙胚的釉结-FGF4 原位杂交定位27-29
• 2.4 小结29-30
• 第三章 诱导多能干细胞向软骨方向分化的体外研究30-46
• 3.1 实验耗材30-31
• 3.1.1 实验器材30
• 3.1.2 实验试剂30-31
• 3.2 实验方法31-39
• 3.2.1 细胞的准备31-32
• 3.2.2 拟胚体（embryonic body, EB）的制备32
• 3.2.3 向软骨方向诱导分化32-33
• 3.2.4 分化过程中样品的收集33
• 3.2.5 RNA 的提取33-34
• 3.2.6 RNA 反转录34
• 3.2.7 qRT-PCR 检测34-35
• 3.2.8 形态观察35
• 3.2.9 冰冻切片35
• 3.2.10 组织切片苏木素-伊红（HE）染色及显微镜下观察35
• 3.2.11 阿利新蓝染色（Alcian blue staining,AB）35
• 3.2.12 免疫组织化学染色35-36
• 3.2.13 免疫印迹实验（Western blot）36-39
• 3.3 实验结果与讨论39-45
• 3.3.1 iPSCs/ESCs 向软骨方向诱导分化过程中形态的变化39-40
• 3.3.2 iPSCs/ESCs 向软骨方向分化的形态观察40
• 3.3.3 iPSCs/ESCs 向软骨方向诱导分化前期中胚层基因表达情况40-41
• 3.3.4 iPSCs/ESCs 向软骨方向诱导分化不同时期软骨相关基因表达情况41-42
• 3.3.5 iPSCs/ESCs 诱导成软骨的胞外基质表达情况42-44
• 3.3.6 iPSCs/ESCs 诱导成软骨的胞外蛋白分泌情况44-45
• 3.4 小结45-46
• 参考文献46-49
• 作者简介49
• 已发表论文49-50
• 致谢50

【共引文献】

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  本文关键词：釉结在牙齿发育中作用的探究及iPS细胞向软骨方向诱导分化的体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：300624