白藜芦醇体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

发布时间：2017-04-12 09:16

  本文关键词：白藜芦醇体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:体外培养分离纯化的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),观察其生长情况及形态,并检测其表面标志物;探索白藜芦醇(Resveratrol)在不同浓度下体外定向诱导hUC-MSCs分化为神经样细胞的条件及作用;观察其形态学改变,检测其基因与蛋白表达水平;为其将来参与基础与临床治疗提供新的理论支持和技术保证。方法:取剖宫产健康足月胎儿的脐带,剔除脐动脉和脐静脉后用D-Hank’s充分冲洗,将获得的脐带间质组织分为大约1mm3大小的组织块,用0.2%胶原酶Ⅱ消化,放入含有20%胎牛血清(FBS)、2 ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)、25 m M左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM/F12中培养。观察获得的原代细胞的形态及生长趋势,当细胞融合达约80%~90%时,加入0.25%胰酶-1m M EDTA消化细胞,并传代。通过流式细胞术检测消化细胞的细胞表型,包括CD105、CD73、CD90、CD11b、CD45、CD34、CD19以及组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作为同型对照。取原代hUC-MSCs按1:1传代,记为P1代,倒置显微镜下动态观察细胞形态及生长变化情况,当细胞融合率达到90%以上时,根据细胞生长状况按1:2或1:3比例进行传代,绘制细胞生长曲线。将处于对数生长期增殖迅速的P5代hUC-MSCs传代至六孔板及25cm2塑料培养瓶中,使用全培养基继续培养,当细胞融合率达约70%-80%时,随机将1个六孔板及3个培养瓶组合为1组,分为四组,前三组作为实验组,第四组为对照组,实验组分别为7.5mg/L、15mg/L、30mg/L的白藜芦醇(Resveratrol)诱导液,诱导液均用无血清L-DMEM培养基配制,各组中六孔板每孔含诱导液2ml,每培养瓶中含诱导液4ml,对照组只加无血清L-DMEM培养基,将各组置于CO_2培养箱(CO_2 5%,37℃)中诱导,培养条件同前,继续培养24小时。倒置相差显微镜动态观察细胞的形态变化,并于各组中随机选取10个非重叠视野,拍照记录视野内总细胞数及神经样细胞的数量,计算神经样细胞在视野内所占的比例,结果以(?)±s表示。四组中诱导于六孔板的细胞于诱导后第4小时终止诱导,采用免疫细胞化学染色检测各组细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况。然后选取较合适的浓度,使诱导于培养瓶的细胞分别于诱导后2、4、6、12、24小时弃去诱导液,用PBS洗涤3次,用Western blot及RT-PCR的方法检测各组细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况。结果:原代hUC-MSCs传代培养12h后,大多数细胞贴壁生长,细胞呈梭形或三角形,随培养时间增加,细胞增殖迅速,贴壁数量明显增多,形状变大,呈长梭形排列。传代至第5d可见细胞呈完全融合状态,以螺旋状或放射状方式排列生长。此后可以按照1:2或1:3的比例进行消化传代进行新一轮的培养,如果没有传代并且继续培养的活细胞在贴壁的基础上会呈螺旋重叠样生长,导致局部密度增高。连续传代培养多次后仍具有较强的增殖能力。通过流式细胞术检测P2、P5及P10代细胞的细胞表型,均表达CD105、CD73及CD90,不表达CD11b、CD45、CD34、CD19以及组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II)。加入诱导液培养,15mg/L组诱导1h后细胞未见明显形态及外观变化,4h后极个别细胞胞体略微收缩,折光性稍显增强,未见突起,并且有少量细胞脱离瓶壁,但未完全脱离漂浮,6h后胞体收缩的细胞数量略显增多,折光性明显增强,呈椭圆形或类圆形,伸出两条或多条长短及粗细不一的细长条突起,突起有分支,数量不等,多数为双极细胞,此时视野中神经样细胞比率仅为5%左右。12h时神经样细胞未见明显增多甚至减少,且存在少量漂浮细胞;30mg/L组诱导1h后神经样细胞阳性率可达50%,多级分化细胞数量较15mg/L组骤增,细胞突起及分支更长,数量更多,各个细胞之间借助伸出的突起及其分支相互交织成网状,4h时阳性细胞比例增加至70%左右,仅见极个别细胞漂浮,6h后可见神经样细胞占视野85%-90%,漂浮细胞较之前稍显增多,12h后神经样细胞比率无明显增加,且漂浮细胞数量增多,24h神经样细胞比例已经降低至70%-80%,漂浮细胞及未完全脱离瓶底的摆动细胞数量进一步增多;7.5mg/L组与空白对照组诱导前后相比较无明显改变,且7.5mg/L组有少量细胞漂浮。当诱导4h时,免疫组织化学染色技术检测结果为15mg/L组和30mg/L组细胞阳性表达Nestin和NSE,GFAP为阴性,阳性细胞可见棕黄色的胞体及紫色胞核。30mg/L组细胞随时间诱导的神经样细胞比率均高于其他组。Western blot及RT-PCR检测结果显示各组GFAP的蛋白及m RNA表达均为阴性。Nestin和NSE的蛋白及m RNA在空白组均有少量表达,Nestin蛋白及m RNA随诱导时间的延长而显著提升,诱导4h时最高,之后降低。NSE蛋白及m RNA随着诱导时间延长逐渐增加,到6h时为最高,其后逐渐降低。结论:hUC-MSCs从人脐带中分离纯化后能够在体外稳定培养及传代,并维持较高的活性;传代培养的hUC-MSCs表达间充质干细胞表型CD105、CD73及CD90,不表达造血干细胞表面标志CD11b、CD45、CD34、CD19以及组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II);Resveratrol在一定浓度下可以在体外有效地将hUC-MSCs诱导分化成神经样细胞,30mg/L为其相对合适的诱导浓度,表达巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。
【关键词】：白藜芦醇 人脐带间充质干细胞 诱导 神经样细胞 免疫组织化学染色 RT-PCR Western blot
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-26
• 结果26-29
• 附图29-39
• 附表39-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 参考文献45-50
• 综述 脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化的研究50-60
• 参考文献55-60
• 致谢60-61
• 个人简历61

【参考文献】

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  本文关键词：白藜芦醇体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：301181