结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究
发布时间：2021-03-19 07:51
目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M. tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且Hsp65-Ag85B优于Hsp65-ESAT6。结论 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测Hsp65-...
【文章来源】：免疫学杂志. 2020,36(02)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
转染293T细胞后的Western blot图谱
免疫后小鼠血清TNF-α的ELISA检测结果
目前免疫原性的检测与疫苗保护效率是结核疫苗的评价的主要方法，而TNF-α是需要关注的重要指标之一，是Mtb刺激机体产生一系列复杂的抗结核免疫相关细胞因子和趋化因子间的相互作用网络的关键调控因子。它作为Th1型反应的促进因子通过活化巨噬细胞和促进结核性肉芽肿形成发挥抗菌作用，还可以调节Mtb感染引起过强的Th1型反应，减轻组织损伤。分泌性蛋白是Mtb生长过程中分泌到胞外的一类蛋白，是目前发现的保护性最好的一组抗原蛋白，对Mtb的防治具有重要意义，能诱导细胞免疫反应，对结核的感染发挥免疫保护作用。ESAT6是一种早期分泌性蛋白，由结核分枝杆菌RD1区的ORF编码，在结核感染早期，可诱导机体产生大量的特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞，在细胞免疫中发挥着重要作用，具有良好的免疫记忆能力，仅存在于致病性分枝杆菌中，在BCG菌株缺失。Ag85B作为另一种在BCG菌株中缺失的重要早期分泌性蛋白，具有较强体液免疫和细胞免疫活性。Hsp65是结核菌在休眠期的重要蛋白，可刺激巨噬细胞吞噬中性粒细胞，促进其分泌抗菌酶类或识别其他病原相关分子模式以引起效应机能，直接增强巨噬细胞介导炎症反应的活性，促进巨噬细胞的凋亡从而起到杀菌作用。研究显示，在Ag85B-HspX融合DNA疫苗免疫小鼠体内TNF-α的含量显著升高。袁伟等人对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因疫苗在小鼠体内的研究也证明了这一结论。本研究将结核菌缺失的早期分泌性蛋白ESAT6和Ag85B分别与休眠期蛋白Hsp65联合，构建于目前唯一公认可以应用于人体实验的载体质粒PVAX1，以期在结核感染早期和潜伏期均产生预防与治疗作用。利用分子生物学的技术，我们通过基因合成，双酶切，连接，成功构建了PVAX1-Hsp65-Ag85B、PVAX1-Hsp65-ESAT6 DNA疫苗，并由菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定了序列的正确性。通过对新型DNA疫苗的体外表达，我们发现DNA疫苗可在体外293T细胞中很好的转录、翻译成免疫蛋白，并在48h时蛋白表达量达最高。由于C57BL/6小鼠可产生较强的细胞免疫反应主要用于研究结核的细胞免疫，本实验将DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠，发现DNA疫苗在免疫小鼠体内激起了很好的特异性细胞免疫应答，其中与PBS组相比实验组血清中细胞因子TNF-α的含量显著升高，为进一步追溯细胞因子TNF-α的来源，我们对实验组脾细胞中CD4+T细胞亚型进行了流式分选，并对细胞因子TNF-α进行了标记，发现细胞因子TNF-α来源于Th1型和Th22型细胞，证明PVAX1-Hsp65-Ag85B、PVAX1-Hsp65-ESAT6 DNA疫苗主要通过激活Th型细胞分泌TNF-α对结核起作用，推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6，还有待攻毒实验验证。此外，该DNA疫苗株与传统结核BCG疫苗的免疫保护效果比较还有待于进一步研究。
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞因子IL-2、IL-12及IL-18增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的免疫保护作用[J]. 尹芳,胡月圆,郭琼,李贵南. 免疫学杂志. 2019(11)
[2]新一代抗结核分枝杆菌疫苗将会建立在现用卡介苗的基础上吗?[J]. 赵爱华,徐苗,王国治. 微生物与感染. 2017(04)
[3]结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究[J]. 王森林,张梦媛,王学坤,周曙光,江振友. 暨南大学学报(自然科学与医学版). 2016(01)
[4]热休克蛋白与结核病关系概述[J]. 李枫,袁俐. 中国病原生物学杂志. 2013(10)
[5]肿瘤坏死因子-α在抗结核免疫中的作用研究进展[J]. 宋艳华,高孟秋. 中国防痨杂志. 2012(04)
[6]小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应[J]. 袁伟,董娜,张丽芳,林树柱,向志光,乔红伟,秦川. 中国比较医学杂志. 2011(06)
本文编号：3089241
【文章来源】：免疫学杂志. 2020,36(02)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
转染293T细胞后的Western blot图谱
免疫后小鼠血清TNF-α的ELISA检测结果
目前免疫原性的检测与疫苗保护效率是结核疫苗的评价的主要方法，而TNF-α是需要关注的重要指标之一，是Mtb刺激机体产生一系列复杂的抗结核免疫相关细胞因子和趋化因子间的相互作用网络的关键调控因子。它作为Th1型反应的促进因子通过活化巨噬细胞和促进结核性肉芽肿形成发挥抗菌作用，还可以调节Mtb感染引起过强的Th1型反应，减轻组织损伤。分泌性蛋白是Mtb生长过程中分泌到胞外的一类蛋白，是目前发现的保护性最好的一组抗原蛋白，对Mtb的防治具有重要意义，能诱导细胞免疫反应，对结核的感染发挥免疫保护作用。ESAT6是一种早期分泌性蛋白，由结核分枝杆菌RD1区的ORF编码，在结核感染早期，可诱导机体产生大量的特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞，在细胞免疫中发挥着重要作用，具有良好的免疫记忆能力，仅存在于致病性分枝杆菌中，在BCG菌株缺失。Ag85B作为另一种在BCG菌株中缺失的重要早期分泌性蛋白，具有较强体液免疫和细胞免疫活性。Hsp65是结核菌在休眠期的重要蛋白，可刺激巨噬细胞吞噬中性粒细胞，促进其分泌抗菌酶类或识别其他病原相关分子模式以引起效应机能，直接增强巨噬细胞介导炎症反应的活性，促进巨噬细胞的凋亡从而起到杀菌作用。研究显示，在Ag85B-HspX融合DNA疫苗免疫小鼠体内TNF-α的含量显著升高。袁伟等人对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因疫苗在小鼠体内的研究也证明了这一结论。本研究将结核菌缺失的早期分泌性蛋白ESAT6和Ag85B分别与休眠期蛋白Hsp65联合，构建于目前唯一公认可以应用于人体实验的载体质粒PVAX1，以期在结核感染早期和潜伏期均产生预防与治疗作用。利用分子生物学的技术，我们通过基因合成，双酶切，连接，成功构建了PVAX1-Hsp65-Ag85B、PVAX1-Hsp65-ESAT6 DNA疫苗，并由菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定了序列的正确性。通过对新型DNA疫苗的体外表达，我们发现DNA疫苗可在体外293T细胞中很好的转录、翻译成免疫蛋白，并在48h时蛋白表达量达最高。由于C57BL/6小鼠可产生较强的细胞免疫反应主要用于研究结核的细胞免疫，本实验将DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠，发现DNA疫苗在免疫小鼠体内激起了很好的特异性细胞免疫应答，其中与PBS组相比实验组血清中细胞因子TNF-α的含量显著升高，为进一步追溯细胞因子TNF-α的来源，我们对实验组脾细胞中CD4+T细胞亚型进行了流式分选，并对细胞因子TNF-α进行了标记，发现细胞因子TNF-α来源于Th1型和Th22型细胞，证明PVAX1-Hsp65-Ag85B、PVAX1-Hsp65-ESAT6 DNA疫苗主要通过激活Th型细胞分泌TNF-α对结核起作用，推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6，还有待攻毒实验验证。此外，该DNA疫苗株与传统结核BCG疫苗的免疫保护效果比较还有待于进一步研究。
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞因子IL-2、IL-12及IL-18增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的免疫保护作用[J]. 尹芳,胡月圆,郭琼,李贵南. 免疫学杂志. 2019(11)
[2]新一代抗结核分枝杆菌疫苗将会建立在现用卡介苗的基础上吗?[J]. 赵爱华,徐苗,王国治. 微生物与感染. 2017(04)
[3]结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究[J]. 王森林,张梦媛,王学坤,周曙光,江振友. 暨南大学学报(自然科学与医学版). 2016(01)
[4]热休克蛋白与结核病关系概述[J]. 李枫,袁俐. 中国病原生物学杂志. 2013(10)
[5]肿瘤坏死因子-α在抗结核免疫中的作用研究进展[J]. 宋艳华,高孟秋. 中国防痨杂志. 2012(04)
[6]小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应[J]. 袁伟,董娜,张丽芳,林树柱,向志光,乔红伟,秦川. 中国比较医学杂志. 2011(06)
本文编号：3089241
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