细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶的表达、定位和诊断价值的初步评价

发布时间：2021-06-21 09:24

　　目的克隆、表达细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶（EgPGAM）,分析其免疫反应性及其在原头节、包囊及成虫中的分布情况,对EgPGAM的诊断价值进行初步评价。方法提取细粒棘球蚴原头节RNA,逆转录为cDNA, PCR扩增EgPGAM基因,测序。通过多种生物信息学软件分析EgPGAM的理化性质、保守结构域、抗原表位和同源性等。利用Mega 5.0软件进行序列特征分析,采用邻接法构建系统进化树。将EgPGAM基因连接至pET32a表达载体,转入大肠埃希菌（E. coli） BL21（DE3）中进行诱导表达,镍柱纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析其表达情况并进行蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析。免疫荧光定位分析EgPGAM在原头节、包囊及成虫中的分布。采用ELISA评价EgPGAM的诊断价值。结果 EgPGAM长756 bp,共编码251个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量（Mr）约28 000,等电点为8.29,不含信号肽,无跨膜区。EgPGAM含有12个高保守的氨基酸位点、 3个保守的催化活性位点、 1个底物结合位点和7个B抗原表位。EgPGAM... 

【文章来源】：中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2020,38(02)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

Eg PGAM PCR扩增结果

SDS-PAGE结果显示，Eg PGAM在E.coli BL21(DE3）中大量表达，主要以可溶蛋白形式存在于上清中，约为Mr48 000（标签约Mr20 000）（图4）。Western blotting分析结果显示，Eg PGAM可与感染细粒棘球蚴的绵羊血清反应，不与健康绵羊阴性血清反应，具有较好的免疫反应性。兔抗Eg PGAM-IgG与原头节总蛋白孵育，只显示单一条带，大小与Eg PGAM一致（图4）。2.4 Eg PGAM的免疫荧光定位

免疫荧光定位实验结果显示，细粒棘球蚴阶段，Eg PGAM分布于原头节表皮层、顶突沟上和包囊生发层；细粒棘球绦虫阶段，Eg PGAM均匀地分布于薄壁组织中，虫卵中无分布（图5）。2.5 间接ELISA测定的Eg PGAM敏感性和特异性

【参考文献】：
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本文编号：3240422