肠道病毒71型2A蛋白在病毒复制能力与毒力中的作用

发布时间：2017-08-01 00:26

  本文关键词：肠道病毒71型2A蛋白在病毒复制能力与毒力中的作用

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【摘要】：肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原体之一,属于小RNA病毒(Picornaviridae)科,肠道病毒(Enterovirus) A属(species A),具有嗜神经性,主要感染婴幼儿和五岁以下儿童。EV71感染造成的HFMD临床症状呈现多样化,一般仅表现为患者手、足、口部位的皮疹和疱疹等,为自限性疾病,但严重时可导致中枢神经系统(central nervous system, CNS)并发症,包括脊髓灰质炎样麻痹、无菌性脑膜炎、脑干脑炎等,甚至造成死亡。EV71全长基因组约为7.4 kb,仅有一个开放阅读框架(open reading fragment, ORF),两端分别为3'UTR和5'UTR区。目前,EV71的致病机制仍不明确,我们之前的研究表明EV71的复制能力与病毒毒力相关。本研究利用反向遗传技术,将EV71山东分离株SDLY107株(分离自死亡患儿)与SDLY1株(分离自轻症HFMD患儿)的2A蛋白进行置换后,构建了具有感染性的嵌合病毒,研究2A蛋白在病毒复制能力和毒力中发挥的作用。目的：1.对EV71不同毒力表型株(SDLY 107株和SDLY1株)的2A进行置换,构建出EV71嵌合体的感染性克隆cDNA,从而拯救出嵌合病毒株SDLY107-2A-1;2.研究原毒株和嵌合毒株在体外和体内复制能力的差异,以期得到2A对病毒复制能力的影响；3.通过体外和体内实验研究原毒株和嵌合毒株对细胞和乳鼠器官损伤作用,以期得到2A对病毒毒力的影响。方法：1.利用重叠PCR的方法,设计合适的引物,获得SDLY1株的2A基因片段,双酶切后置换到含有SDLY 107株全长的质粒pMD-19T中,利用体外转录获得感染性RNA后,转染至Vero细胞,观察到明显细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)后,盲传三代,拯救出嵌合病毒SDLY 107-2A-1株；2.用EV71通用引物EV71-S和EV71-A扩增嵌合毒株的VP1片段,凝胶电泳进行鉴定；以SDLY 107株免疫ICR小鼠获得的抗血清作为一抗,利用间接免疫荧光和免疫印迹等方法对嵌合病毒株进行鉴定,测序验证后,用50%中点法和空斑试验测定病毒滴度；3.将强毒株SDLY 107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY 107-2A-1株分别感染细胞48 h后,利用LDH试验和CCK-8试验检测不同毒株感染Vero细胞和RD细胞造成的细胞损伤差异；4.将强毒株SDLY 107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY 107-2A-1株分别感染细胞,在不同温度下(37℃和39℃)进行培养,每12h取一次上清,连续取样5 d,样本统一冻存于-80℃。取样完成后,提取病毒RNA,反转录成cDNA后,利用实时荧光定量PCR (real time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测病毒体外动力学曲线,比较不同毒株在体外的复制动力学差异；5.将一日龄ICR乳鼠分为8组,每组11只,实验组乳鼠分别用SDLY 107株、SDLY1株、SDLY 107-2A-1株感染,每株病毒接种两组,另设两组对照组；另将一周龄ICR乳鼠分为5组,每组11只,将SDLY 107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株分别感染一组一周龄ICR乳鼠,另设一组对照组；感染途径为腹腔注射,其中对照组用生理盐水注射；每天观察一日龄乳鼠感染组及对照组的临床体征并记录乳鼠体重；6.在感染后0 d-11 d连续采集乳鼠后肢肌肉组织,提取病毒RNA,反转录成cDNA后,利用qRT-PCR检测病毒在体内复制曲线；在感染后1 d、5 d和9d采集乳鼠肺组织、脑组织、后肢肌肉组织和小肠组织,HE染色观察乳鼠器官病变情况,免疫组化实验检测病毒抗原；结果：1.PCR、间接免疫荧光、免疫印迹及测序证明嵌合病毒拯救成功,且测出SDLY107株、SDLY 1株、SDLY 107-2A-1株滴度分别为2.22×105PFU/ml、 0.65×105PFU/ml、1.25×105PFU/ml;2.LDH实验和CCK-8实验表明嵌合毒株SDLY 107-2A-1株对细胞的损伤作用弱于强毒株SDLY 107株,强于弱毒株SDLY1株(P0.05)；3. qRT-PCR结果显示嵌合毒株SDLY 107-2A-1株在体外37℃和39.5℃条件下复制能力均弱于强毒株SDLY 107株,强于弱毒株SDLY1株；嵌合毒株在乳鼠体内复制能力弱于强毒株,强于弱毒株；4.HE病理染色情况和免疫组化实验结果表明嵌合毒株对一日龄乳鼠器官造成的病理损伤介于强毒株和弱毒株之间；在乳鼠后肢肌肉组织中可检测出嵌合毒株、强毒株及弱毒株的抗原,在脑组织中仅可检测到嵌合毒株和强毒株的抗原。结论：1.成功拯救了嵌合体病毒SDLY 107-2A-1株,其产生的细胞病变效应和亲本病毒株SDLY 107株相似；2.EV71嵌合毒株和亲本毒株在体内外复制能力均有差异,表明2A蛋白在病毒复制能力过程中发挥作用,但2A蛋白并不是温度敏感位点；3.EV71嵌合毒株和亲本毒株对细胞和乳鼠器官组织的损伤作用均有差异,表明2A蛋白在病毒毒力中为关键蛋白；4.嵌合毒株和强毒株均可在脑中复制,但弱毒株在脑中没有复制能力,这些结果说明2A蛋白并不能影响病毒侵入神经系统和在脑内复制的能力,这说明EV71是通过2A以外的机制侵入神经系统,这进一步说明了EV71的神经毒力机制的复杂性。
【关键词】：EV71 嵌合病毒 2A蛋白 病毒复制 毒力
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-16
• 前言16-22
• 材料和方法22-43
• 一、试剂22-30
• 二、仪器30-31
• 三、方法31-43
• 结果43-55
• 一、EV71毒株2A蛋白的氨基酸序列比对43
• 二、EV71嵌和病毒感染性克隆的构建43-45
• 三、EV71嵌和病毒的拯救与鉴定45-48
• 四、EV71体外复制动力学48-49
• 五、EV71对细胞的损伤49-50
• 六、EV71对ICR乳鼠的组织病理损伤50-52
• 七、EV71在乳鼠体内的分布52-53
• 八、EV71体内复制动力学53-55
• 讨论55-59
• 结论59-60
• 创新与不足之处60-61
• 附录附图61-63
• 参考文献63-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表的论文及专利72-74
• 学位论文评阅及答辩情况表74

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本文编号：601797