miR-144对树突状细胞免疫学功能的影响及作用机制研究

发布时间：2017-08-01 00:27

  本文关键词：miR-144对树突状细胞免疫学功能的影响及作用机制研究

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【摘要】：DCs是参与机体内抗原加工处理及递呈的重要免疫细胞,是连接固有免疫和适应性免疫应答的关键,在启动特异性免疫应答及诱导、维持免疫耐受方面具有重要作用。移植免疫学研究证实,DCs既可以分泌促炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1促进自身活化提升递呈抗原能力,又可以通过促炎性因子刺激T细胞分化和增殖,启动免疫应答反应。另一方面,越来越多的研究者发现体内存在一种负向调控的DC亚群—耐受型DCs,Tol DCs可以分泌抗炎性细胞因子IL-10或抑制性分子ILT-2、ILT-4、HLA-G等负向调控T细胞介导的免疫应答反应,诱导并维持免疫耐受的产生。通过干预DCs的功能来调控机体内免疫状态,对移植排斥反应、自身免疫性疾病、肿瘤的防治具有重要的现实意义。基于DCs在移植免疫中的特殊地位,对DCs分化过程中重要调节分子的研究有助于探索移植免疫排斥、自身免疫性疾病、肿瘤的发生中的免疫应答产生及调控机制。mi RNAs是一类高度保守、广泛表达于细胞内的非编码小分子RNA,约22~24nt,可通过结合目的基因的3′非翻译区抑制其翻译从而发挥免疫调控作用。近年来,mi RNAs对机体免疫系统的调控作用研究已受到众多研究者的广泛关注。在免疫细胞的研究中发现,mi RNAs在T、B淋巴细胞的活化、增殖中发挥着重要的调节作用。但是,在mi RNAs对DCs分化的研究较少。本研究中,我们分析实验室前期工作中已有的关于DCs成熟过程中mi RNAs差异性表达的芯片数据,发现mi R-144在成熟后的DCs中出现显著下调,提示在DCs成熟过程中mi R-144可能是一个重要的负性调控因子。因此,本论文研究目的是为了探讨mi R-144对DCs免疫学功能的影响及其具体作用机制,为移植排斥的防治提出新的途径和策略,为mi RNAs在移植排斥反应防治上提供了理论基础及应用的可能性。研究共分三个部分:(1)mi R-144在树突状细胞成熟前后的差异性表达;(2)mi R-144对树突状细胞分泌细胞因子的影响及机制研究;(3)mi R-144在树突状细胞介导Th17免疫反应中的作用研究。一、mi R-144在树突状细胞成熟前后的差异性表达目的:应用软件包分析DCs成熟过程中mi R-144差异性表达的mi RNAs芯片数据并进行验证。方法:从C57BL/6小鼠四肢骨分离的骨髓细胞细胞悬浮于含10%FBS的RPMI-1640培养液中。调整细胞浓度为2.5×109/L接种于1%明胶包被的6孔板内并加入10ng/ml GM-CSF及10ng/ml IL-4,置于CO2培养箱中培养。48小时后小心吸去悬浮细胞及培养液(去除粒细胞),保留贴壁细胞;继续培养至第5天半量换液,至第七天吹打收集细胞。工作浓度1000ng/ml的LPS刺激后,8小时收集细胞。培养的细胞于倒置显微镜下进行一般形态学观察。应用软件包分析实验室已有的关于mi RNAs在DCs成熟过程中差异表达的micro RNAs芯片检测数据。收集LPS刺激诱导的DCs与未刺激的DCs,抽提细胞总RNA。通过RT-PCR技术检测DCs成熟前后mi R-144表达量的变化,对比micro RNAs芯片数据进行验证。结果:从micro RNAs芯片检测数据中筛选出DCs成熟分化过程中mi R-144出现差异性表达,通过RTPCR进一步检测表明mi R-144在小鼠成熟后的DCs中出现显著性下调(P0.01)。结论:mi R-144在树突状细胞成熟前后呈差异性表达。二、mi R-144对树突状细胞分泌细胞因子的影响及机制研究目的:探讨mi R-144在DCs分泌细胞因子中的影响及其作用机制。方法:将mi R-144 inhibitors和mimics转染至DCs,转染48小时后收集细胞,用1000ng/ml的LPS刺激成熟。通过RT-PCR检测LPS刺激成熟后的DCs分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表达量的变化,ELISA检测RANKL蛋白定量表达水平。Western blot检测LPS刺激成熟后的DCs过程相关的信号通路活化情况。根据生物学信息相关软件和数据库预测mi R-144可能存在的潜在作用靶点,并通过荧光素酶报告检测验证mi R-144与RANKL之间存在靶向关系。构建si RANKL和稳定过表达RANKL的DC2.4细胞系,进一步验证mi R-144可以通过靶向作用调控DCs分泌细胞因子。结果:转染mi R-144 inhibitor可显著上调TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表达,转染mi R-144 mimics可显著下调上述细胞因子表达。且高表达mi R-144可以抑制p65活化。通过KEGG及Target Scan软件在TLR4/NF-κB信号通路中mi R-144有一个靶基因NF-κB受体活化因子配体(RANKL),存在两个保守的结合位点。荧光素酶报告研究显示:mi R-144 inhibitor可以上调荧光素酶活性,而mi R-144 mimics则下调荧光素酶活性。应用点突变证实mi R-144的结合位点为RANKL 3′非翻译区679-685处,调控作用是通过抑制其m RNA翻译来实现的。mi R-144可以通过靶向RANKL影响DCs产生细胞因子。结论:mi R-144可以通过靶向RANKL影响DCs的免疫学功能。三、mi R-144在树突状细胞介导Th17免疫反应中的作用研究目的:建立稳定的CD4+T细胞与DCs共培养诱导Th17细胞的细胞培养体系,探讨mi R-144在DCs诱导Th17分化及分泌细胞因子中的作用。方法:将从C57BL/6小鼠脾细胞分选的CD4+T细胞与转染mi R-144 inhibitors、mi R-144 mimics的DCs共培养,并在细胞混悬液中加入适量的游离抗CD3、TGF-β1、IL-6、IL-1β、抗IL-2、抗IFN-γ、抗IL-4、IL-23。于5%CO2孵箱中培养4天后,加入PMA、Ionomycin、Brefeldin A继续刺激5-12小时,即可获得Th17细胞。通过流式细胞技术检测共培养体系中诱导的Th17细胞比例,ELISA检测共培养上清液中IL-17表达。结果:与对照组相比,转染mi R-144mimics可以抑制CD4+T细胞向Th17细胞转化,并抑制IL-17分泌;转染mi R-144 inhibitors则可促使CD4+T细胞向Th17细胞转化,上调IL-17表达。结论:mi R-144可通过靶向作用影响DCs诱导CD4+T细胞向Th17细胞的分化并影响IL-17的分泌。
【关键词】：microRNA miR-144 DCs NF-kB RANKL 细胞因子 Th17
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-12
• 前言12-14
• 第一部分miR-144在树突状细胞成熟前后的差异性表达及验证14-22
• 一、材料与方法14-18
• 二、结果18-20
• 三、讨论20-22
• 第二部分miR-144对树突状细胞分泌细胞因子的影响及机制研究22-34
• 一、材料与方法22-27
• 二、结果27-32
• 三、讨论32-34
• 第三部分miR-144在树突状细胞介导Th17细胞免疫反应中的作用研究34-40
• 一、材料与方法34-36
• 二、结果36-38
• 三、讨论38-40
• 参考文献40-43
• 文献综述43-59
• 参考文献52-59
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况59-60
• 致谢60

【参考文献】

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1 司中洲;李亭;李杰群;齐海智;谢续标;;白细胞介素-17与Th17细胞在小鼠肾移植急性排斥反应中的表达及意义[J];南方医科大学学报;2011年08期

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本文编号：601799