食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的初步研究

发布时间：2017-09-02 05:29

  本文关键词：食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的初步研究

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【摘要】：艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是人类重大疾病,虽然国内外已开展了大量的探索性研究,至今未见有效的防治手段,其主要原因之一是缺少能够感染HIV(Human immunodeficiency virus)致病的动物疾病模型。目前诸多研究发现TRIM5alpha(Tripartite motif protein 5 alpha)是抑制HIV感染的限制因子,能抑制多种逆转录病毒,它是重要的抗病毒因子。TRIM5α包含了RING结构域、B-Box结构域、Coiled-coil结构域和SPRY(B32.0)结构域。HIV包膜和宿主细胞膜融合之后,衣壳和TRIM5α蛋白多聚体特异性的结合,TRIM5α发挥泛素连接酶的活性,干扰了病毒脱衣壳的有序过程,从而达到抑制病毒的目的。TRIM5α在细胞内主要以三聚体的形式存在,胞质内的TRIM5α蛋白具有实质抑制HIV-1的能力。食蟹猴TRIM5α比人类TRIM5α有更强的抑制HIV-1逆转录的效力。本研究试图通过敲低食蟹猴TRIM5α基因,建立有可能感染HIV的动物模型及探究TRIM5α的重要功能。基于此,本研究针对食蟹猴TRIM5α基因,利用RNAi(Ribose nucleic acid interfere)技术合成了相应的shRNA(Short hairpin RNA),构建了含有相应shRNA序列的3个shRNA质粒,分别命名为shRNA1质粒、shRNA2质粒和shRNA3质粒。将表达质粒和包装质粒共转染293T细胞,制作出相应的慢病毒载体。将得到的慢病毒分别感染食蟹猴胚胎成纤维细胞(Cynomolgus monkey embryo fibroblast,CMEF),被感染的细胞通过流式细胞仪分选得到稳定表达的CMEF细胞系,分别命名为NTC(Negative Temperature Coefficient)-CMEF、shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF细胞。通过qRT-PCR分别检测TRIM5α基因的表达水平,结果发现NTC-CMEF细胞内TRIM5α基因水平是野生型CMEF表达水平的97%,shRNA1-CMEF、shRNA2和shRNA3细胞内的TRIM5α基因水平分别是野生型CMEF的52%,43%和39%。通过Western blot检测TRIM5α的蛋白表达水平,结果发现NTC-CMEF细胞内TRIM5α蛋白表达水平是野生型CMEF表达水平的108%,shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF细胞内的TRIM5α蛋白基因水平分别是野生型CMEF的59%,47%和49%。在验证TRIM5α敲低对HIV病毒感染方面,利用表达RFP的假HIV病毒,分别对NTC-CMEF、shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF细胞进行再次感染实验,结果表明TRIM5α基因敲低后的食蟹猴细胞系相对野生型细胞可以抑制假HIV-1病毒的感染能力。在食蟹猴胚胎上初步验证了shRNA3慢病毒载体的感染能力。综上所述,本研究成功获得了在细胞水平上得到验证的食蟹猴TRIM5α基因敲低的慢病毒载体,并在食蟹猴胚胎上进行了初步研究。本论文研究为建立艾滋病疾病动物模型提供了重要的思路和依据。
【关键词】：HIV-1 TRIM5α 基因敲低 食蟹猴
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.91;R-332
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstracts5-11
• 第1章 前言11-22
• 1.1 艾滋病和HIV11-14
• 1.1.1 HIV分类和起源11
• 1.1.2 HIV-1 进化11-12
• 1.1.3 艾滋病的治疗12-13
• 1.1.4 中国艾滋病疫情现状13-14
• 1.2 艾滋病动物感染模型14-17
• 1.2.1 鼠疫缺陷鼠模型14
• 1.2.2 猫和兔感染模型14-15
• 1.2.3 马感染模型15
• 1.2.4 黑猩猩与食蟹猴模型15-16
• 1.2.5 SHIV动物感染模型16-17
• 1.3 天然免疫分子TRIM5α17-21
• 1.3.1 TRIM5α 分子的来源17
• 1.3.2 TRIM5α 与TRIM蛋白家族17-19
• 1.3.3 TRIM5α 限制HIV复制的机制19-21
• 1.3.4 TRIM5α 基因敲低21
• 1.4 慢病毒载体21-22
• 第2章 材料方法22-37
• 2.1 实验材料22-23
• 2.1.1 细胞株、质粒、菌株22
• 2.1.2 主要试剂和溶液22-23
• 2.1.3 主要仪器设备23
• 2.2 实验方法23-37
• 2.2.1 基础实验方法23-24
• 2.2.2 表达单个shRNA重组慢病毒质粒构建24-26
• 2.2.3 慢病毒的包装26-27
• 2.2.4 重组慢病毒感染CMEF细胞及细胞系筛选27-28
• 2.2.5 TRIM5α 基因敲低对mRNA表达的影响28-29
• 2.2.6 Western Blot29-32
• 2.2.7 功能验证32
• 2.2.8 胚胎操作32-37
• 第3章 结果与分析37-50
• 3.1 shRNA重组慢病毒表达质粒构建37-39
• 3.2 shRNA重组慢病毒包装39-40
• 3.3 流式分选得到TRIM5α 基因敲低的细胞系40-42
• 3.4 QRT-PCR结果42-46
• 3.5 Western Blot结果46-47
• 3.6 功能验证结果47-48
• 3.7 激光共聚焦观察食蟹猴胚胎结果48-49
• 3.8 小结49-50
• 第4章 讨论与结论50-54
• 4.1 RNA干扰的应用50-51
• 4.2 慢病毒载体的优势与不足51-52
• 4.3 用HIV-1 假病毒来进行功能分析的讨论52
• 4.4 结论52-54
• 致谢54-56
• 参考文献56-60

【参考文献】

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本文编号：776671