重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

发布时间：2017-09-16 05:40

  本文关键词：重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

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【摘要】：目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测。方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd。运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性。结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。
【作者单位】： 第四军医大学西京医院;第四军医大学药学系生物技术中心;
【关键词】： 重组人脂联素球状结构 表达纯化 心脏保护
【基金】：国家重大新药创制(2009ZX09103-673) 国家自然科学基金(81170186、81100136) 新世纪优秀人才支持计划(2011SXJ01)资助项目
【分类号】：R341
【正文快照】： 脂联素主要是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子,是一种与细胞外基质相互作用的血浆蛋白,具有调节血糖、血脂,抗炎及改善血管内皮功能等多种作用,其含量和活性改变与肥胖、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病的发生有密切的关系[1-2]。研究表明,给予外源性脂联素能够改善糖尿病动物胰岛

【参考文献】

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1 王云龙;李永超;昌静峰;李玉林;王国强;邓黎黎;陈冬焕;董彩文;孙新城;刘旺根;梁晓艳;;人脂联素原核表达纯化及活性检测[J];动物医学进展;2011年10期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张立剑;孙璐;李冬冬;郭云萍;王增禄;刘毅;张英起;陶凌;;无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测[J];生物技术通讯;2013年02期

【二级参考文献】

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1 王雪,宋长征;蛋白质复性的条件及影响因素[J];国外医学(分子生物学分册);2003年06期

2 刘德敏,靳立忠,孙颖,张捷;人脂联素cDNA的克隆及序列分析[J];天津医药;2005年02期

3 史晓文;刘德敏;孙颖;张捷;;人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达[J];天津医药;2008年11期

4 杨泽华,解军,于保锋,杨琦,张悦红,牛勃;人脂肪细胞总RNA的抽提及对脂联素mRNA的扩增[J];中国药物与临床;2005年04期

5 李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭;;人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达[J];中国糖尿病杂志;2007年06期

【相似文献】

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1 李孜,余新炳,吴忠道,徐劲,胡旭初;日本血吸虫p50亲免素基因克隆、表达及纯化[J];中国公共卫生;2005年11期

2 谢瑞芹;李荣芹;崔炜;郝玉明;李保华;吴金凤;杜国英;张涛;刘凡;;猪骨骼肌缺血预适应降低心肌缺血再灌注后基质金属蛋白酶的表达[J];基础医学与临床;2006年03期

3 王黎芳;周毓玲;顾洁;韩忠朝;;重组凝血酶敏感蛋白-1N端片段对CD36表达阴性的ECV304细胞增殖的抑制[J];中国生物工程杂志;2006年04期

4 张连英;何汉江;尹卫国;汪文玉;占利生;谭立志;;问号状钩端螺旋体外膜蛋白Loa22的克隆、表达及对豚鼠的免疫保护作用研究[J];实用预防医学;2007年06期

5 龚艺;崔亚利;牛司强;张雪梅;胥文春;何於娟;王虹;;肺炎链球菌假想蛋白SPD0414的表达纯化及保守性分析[J];中国免疫学杂志;2010年09期

6 马祖兴;高宁;绳纪坡;于芳;林宇翔;罗维;柯波;胡宝成;;人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备[J];军事医学;2011年01期

7 刘广洋;姚伟;任亚萍;李玉;张英;任魁;张岩锐;沈心亮;;乙型肝炎病毒核心抗原蛋白表达纯化及免疫学分析[J];药物生物技术;2006年03期

8 刘志刚;何毅华;高波;;德国小蠊变应原Bla g2的克隆、表达及其免疫学特性鉴定[J];中国人兽共患病学报;2007年03期

9 郑小斌;黄巧冰;;从心、脑保护的共性探讨缺血预适应信号转导机制[J];中国病理生理杂志;2010年07期

10 高辉,高磊,纪宗玲,路凡,陈南春,陈苏民,余宙耀,张宜俊,尤玉琴,粟宽源;一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析[J];细胞与分子免疫学杂志;1998年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 包洪;刘爱忠;尹文东;李艳蕾;于庭;;呼吸道合胞病毒F蛋白基因片段真核表达纯化及ELISA方法建立的研究[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

2 王淳;陈誉华;;大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白yijP的表达纯化和功能分析[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年

3 张鹰;文玲英;孙力;储冰峰;;变形链球菌IuxS与pfs基因的分子克隆,表达纯化与定量[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年

4 侯登勇;张英起;颜真;;人TRAIL基因的克隆表达纯化和活性测定[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

5 冯怡;崔立斌;刘传喧;马清钧;;Endostatin在毕赤酵母中的表达纯化及其生物功能研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

6 秦莉;吴少庭;王西明;袁仕善;黄达娜;雷民军;潘晖榕;高世同;张仁利;屈伸;;SARS冠状病毒S蛋白片段2的表达纯化与多克隆抗体的制备[A];全国新出现传染病学术研讨会资料汇编[C];2004年

7 崔宇杰;董宁征;庞爱明;白霞;阮长耿;;人源性Fab噬菌体抗体库的构建和血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体的筛选、表达及鉴定[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年

8 孟晋宏;罗娜;王亚周;鞠躬;;不同因子对人源性成神经元细胞系SH-SY5Y的作用[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

9 王刚;刘玉峰;王琰;;人源性抗角蛋自抗体的基因克隆、表达及亲和力成熟[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年

10 侯秉璋;赵禹;刘嘉玉;张墨玲;乔玲;陈昆明;;人源性TRAb组合文库的构建[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年

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1 记者 生焰明 李玉成;防治内毒血症添“利器”[N];健康报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 苏海川;肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆、表达纯化以及生物活性的初步研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

2 刘东;乙型肝炎病毒HBx蛋白的表达纯化及全基因组蛋白与宿主蛋白之间相互作用组模型的建立[D];第三军医大学;2008年

3 黄耀江;IL-6相关新基因的克隆鉴定、表达纯化及结构功能预测[D];大连理工大学;2001年

4 唐蓓;人TRAIL分子胞外区的克隆、表达纯化及生物学活性鉴定[D];重庆大学;2003年

5 刘海伟;CREG表达调控人血管平滑肌细胞HITASY表型转换机制研究[D];第四军医大学;2004年

6 杨秀清;抗B型肉毒毒素鼠源中和抗体快速制备及其免疫学活性的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

7 马慧娟;活性氧在慢性间歇性低压低氧适应性心脏保护形成中的作用和机制[D];河北医科大学;2012年

8 彭享胜;心肌梗死小型猪围术期模型的构建及内源性血红素氧合酶-1心脏保护作用的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年

9 陶俊;人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定[D];南方医科大学;2010年

10 李承新;人源性抗角蛋白单链抗体的构建、表达和Fab片段生物学作用及其分子机理的研究[D];第四军医大学;2001年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 黄宗炎;梅毒螺旋体抗原在毕赤酵母中的表达纯化和单克隆抗体的制备[D];西北大学;2006年

2 王殿丽;JC病毒VP2蛋白的抗原抗体制备及核定位信号与入核转运受体的鉴定[D];大连医科大学;2008年

3 夏芸;红系转录因子FKLF的表达纯化及初步研究[D];华东师范大学;2004年

4 张明;CUEDC2的表达纯化与溶液结构初步探索[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

5 邱壮伟;靶向HER2的人β防御素2的表达纯化及体外活性研究[D];暨南大学;2012年

6 朱庆华;人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env抗原的表达[D];郑州大学;2009年

7 赵晓兵;Bcl-2在骨骼肌远隔后处理心脏保护中的作用及机制[D];河北医科大学;2012年

8 陈凌;小鼠AMcase基因克隆表达、蛋白纯化及抗真菌功能的初步研究[D];第四军医大学;2006年

9 张俊艳;甘氨酸受体在大鼠心肌细胞的表达[D];暨南大学;2006年

10 汪春军;结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统蛋白的表达纯化研究[D];北京林业大学;2011年

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本文编号：861246