骨髓间充质干细胞在难愈性创面血管生成及愈合中的作用研究

发布时间：2017-11-22 15:29

  本文关键词：骨髓间充质干细胞在难愈性创面血管生成及愈合中的作用研究

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【摘要】：研究背景和目的 难愈性创面常见于糖尿病、肢端循环障碍、以及深度创伤等疾病。如何促进这类损伤的愈合一直是创伤领域研究的重要课题。尽管对创伤愈合的病理生理机制已有深刻的认识,在治疗措施上也积累了丰富的经验,但目前对难愈创面的治疗,仍缺乏十分有效的方法,特别是对糖尿病晚期继发性难愈创面患者而言,虽然目前的常规治疗和FDA批准的生长因子等非常规治疗手段也有一定疗效,但疗效不如预期,对部分患者甚至无效。缺血所导致的机体内环境改变是影响创面修复与愈合的重要机制之一,如何针对机理筛选有效的外源性抗损伤物质防治缺血损害是治疗的新措施。 已有研究证明MSCs在伤口的愈合中可以分化为其他细胞从而促进创面的愈合,但是MSCs旁分泌的一些可溶性因子可调控局部细胞反应,在促创面愈合方面这些因子可能发挥了更重要作用。当组织血管化受损时,MSCs可以通过分泌SDF-1、VEGF、IGF-1、EGF、KGF.血管生成素-1、MIP-1α、EPO、MMP-9等通过刺激EPCs的动员、扩增以及分化从而促进血管新生以及组织再生,因此,MSCs有望在促难愈创面愈合方面产生积极影响。 难愈创面临床上以糖尿病创面最为常见,本次试验以糖尿病小鼠模型为基础建立难愈创面模型,通过创面局部移植BMMSCs的方法,来探讨BMMSCs在难愈创面修复过程中的血管新生以及促愈合的作用。糖尿病作为一种慢性代谢性疾病,长期的高血糖易导致多种并发症,因此患者自身BMMSCs的生物学效能也可能受到一定影响。因此在本实验中,我们也探讨了正常小鼠BMMSCs和糖尿病小鼠BMMSCs在体外环境下生物学效应的差异,并对比两种来源的BMMSCs对难愈创面的修复差异。 研究内容和方法 1、Ⅱ型糖尿病模型的建立 以C57BL/6小鼠和C57BL/6背景的GFP小鼠为实验用鼠,并长期高脂高糖小鼠饲料喂养。链脲佐菌素(STZ)40mg/kg体重,连续三次腹腔注射,诱导Ⅱ型糖尿病小鼠模型。选取空腹血糖大于等于16.7mmol/L、且持续两周的小鼠为Ⅱ型糖尿病动物模型。 2、正常小鼠和糖尿病小鼠GFP-BMMSCs的分离培养 颈部脱臼法处死两组GFP小鼠并用75%酒精消毒后,在超净台中分离出胫骨和股骨,切除骨的两末端以暴露骨髓腔,用注射器反复冲洗髓腔至髓腔发白,收集全骨髓细胞,含10%FBS的完全培养液(含双抗)体外培养,通过换液去除非贴壁细胞,细胞融合生长达90%后用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验采用P3代细胞。 3、正常小鼠和糖尿病小鼠GFP-BMMSCs成骨、成脂鉴定 两组均选取对数生长期P3代BMMSCs.小鼠成骨诱导液诱导培养,每72h换液,诱导20d后,行茜素红染色了解成骨情况；小鼠成脂诱导体系分A液和B液,先加A液诱导72h,然后换B液维持24h,3个循环后行油红O染色了解成脂情况。 4、正常小鼠和糖尿病小鼠GFP-BMMSCs表面抗原检测 均选取对数生长期P3代BMMSCs,将细胞悬液分装到流式管中,200g1/管,含1×106个细胞,分别加入PE荧光标记的Sca-1、CD14、CD29、CD34、CD45、 CD90、CD105抗体,流式细胞仪检测细胞各标记的荧光值,其中用PE标记的小鼠IgG抗体作为阴性对照。 5、实验动物分组 选取60只C57BL/6小鼠Ⅱ型糖尿病模型,在每只小鼠左下肢相同部位构建直径6mm圆形创面。第一组创面注射1×106个正常GFP小鼠P3代BMMSCs为正常BMMSCs组,n=20；第二组创面注射1×106个糖尿病GFP小鼠P3代BMMSCs为糖尿病BMMSCs组,n=20；第三组创面注射同剂量PBS为PBS组,n=10;第四组不作任何处理为对照组,n=10。其中正常BMMSCs组和糖尿病BMMSCs组检测时间点为Od、2d、7d、14d, PBS组和对照组检测时间点为7d、14d,每个时间点检测每组样本n=5。 6、GFP-BMMSCs荧光示踪 因PBS组和对照组创面未注射BMMSCs,只检测正常BMMSCs组和糖尿病BMMSCs组创面中的GFP-BMMSCs.每组分别取0d(注射后1h)和2d新鲜创面组织,用OCT包埋后冰冻切片,切片厚度6μm, DAPI荧光标记细胞核,倒置荧光显微镜分别在激发光340nm和509nm通道下观察并照相。 7、创面VEGF表达水平检测 检测时间点为7d和14d。各组创面新鲜组织OCT包埋后冰冻切片,切片厚度6μm,4%多聚甲醛固定10min,0.5%Triton-X-100常温孵育30min以透化细胞,进口羊血清封闭液封闭60min,加小鼠来源VEGF一抗稀释液(1：100)4℃过夜,室温平衡30min后加入Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)室温避光孵育2h,DAPI荧光标记细胞核,倒置荧光倒置显微镜下观察并照相,Image-Pro Plus6.0图像分析软件计算平均光密度值(OD)。 8、病理组织学检查 检测时间点为7d和14d。创面组织10%福尔马林固定24h后石蜡包埋,组织常规石蜡切片,切片厚度5μm,行HE染色,光学显微镜下观察并照相。 9、创面面积 数码相机记录每组0d、7d、14d整体创面愈合情况,Image J软件测量创面面积,计算7d、14d愈合率。 10、统计学处理 本次试验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两样本间比较用独立样本T检验,数据结果以x±s表示,P0.05表示有统计学差异。 结果 1、GFP-BMMSCs分离培养及成骨成脂能力鉴定 正常GFP小鼠BMMSCs接种24h后细胞开始贴壁生长,3d后贴壁细胞增多,接种后7d贴壁细胞明显增多,大克隆呈圆盘状,细胞多呈纺锤形或梭形。接种后10-12d大克隆之间逐渐融合,呈辐射状或漩涡状排列,并铺满整个培养瓶底部。Ⅱ型糖尿病GFP小鼠BMMSCs与正常GFP小鼠BMMSCs相比,3d贴壁细胞较少,细胞生长状态较差,接种后10-12d克隆形成较少。 用成骨诱导液诱导培养正常GFP-BMMSCs第18d,细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构,钙结节形成明显；诱导20d后进行茜素红染色,染色呈红色结节,显示成骨分化阳性。说明BMMSCs在成骨诱导液诱导下可以向成骨细胞分化。Ⅱ型糖尿病GFP-BMMSCs在成骨诱导液诱导培养20d后,进行茜素红染色,染色呈红色结节,提示成骨分化阳性,但红色结节较正常GFP少,细胞集落样生长较小。 用成脂诱导液诱导培养正常GFP-BMMSCs第12d后,细胞形态变圆,胞浆内充溢脂滴。用油红O染色,脂肪化诱导后细胞内充满大小不一的红色脂滴,显示成脂分化阳性。说明BMMSCs在成脂诱导液诱导下分化为脂肪细胞。Ⅱ型糖尿病GFP-BMMSCs在成脂诱导液诱导培养12d后,油红O染色,胞浆内亦有红色脂滴,但与正常GFP-BMMSCs相比,脂滴大小较小且数量较少。 2、GFP-BMMSCs表面抗原检测 流式细胞仪检测正常GFP小鼠与Ⅱ型糖尿病GFP小鼠BMMSCs特异性分子标记显示：两组BMMSCs造血干细胞、淋巴细胞分子标记CD14、CD34、CD45均为阴性,间充质干细胞特异分子标记Sca-1、CD29、CD90、CD105均为阳性,分别统计分析两组阳性率显示,正常BMMSCs组分别为：94.72±4.82%、96.42±3.79%、97.77±2.86%、94.49±4.85%,糖尿病BMMSCs组分别为：91.72±5.51%、79.14±7.41%、70.59±7.26、92.44±4.90%。独立样本T检验统计方法分析表明,两组之间比较Sca-1P=0.386、CD29P=0.002、CD90P=0.000、CD105P=0.524,两组之间CD29和CD90阳性表达率均有显著差异。 3、GFP-BMMSCs荧光示踪 0d(注射后1h)GFP-BMMSCs两组均较多,正常BMMSCs组为：46.8±8.9个/200倍视野,糖尿病BMMSCs组为：45.8±8.1个/200倍视野,独立样本T检验显示,独立样本T检验统计方法分析表明,P=0.858两者之间无差异；2d时正常BMMSCs组为：12.2±3.7个/200倍视野,糖尿病BMMSCs组为：5.6±2.6个/200倍视野,独立样本T检验统计方法分析表明,P=0.012,两者之间有统计学差异。 4、各组创面VEGF表达水平检测 荧光显微镜下,VEGF呈红色荧光,7d时对照组和PBS组表达很少,两者之间无明显差异,正常BMMSCs组表达较多,糖尿病BMMSCs组表达较正常BMMSCs组少,但多于对照组和PBS组；14d时对照组和PBS组表达较7d有所增加,但主要分布于真皮层下层且分布稀疏,两者之间无明显差异,正常BMMSCs组表达分布最广泛,且已靠近表皮层,糖尿病BMMSCs组较正常BMMSCs组表达稀疏,但多于对照组和PBS组。统计分析各组不同时间平均光密度值(OD),正常BMMSCs组和糖尿病BMMSCs组与PBS组、空白组比较,P0.05；糖尿病BMMSCs组、PBS组和空白组与正常BMMSCs组比较,P均0.05。 5、各组创面病理组织学检查 HE染色显示,7d时对照组和PBS组皮肤表面可见较厚的血痂,皮下炎症浸润严重,可见大量炎症细胞,胶原纤维形成很少；正常BMMSCs组表皮血痂较少,皮下炎症环境改善明显,炎症细胞较对照组和PBS组大量减少,胶原纤维形成较多,但糖尿病BMMSCs组炎症环境改善和胶原纤维形成均不如正常BMMSCs组明显。14d时对照组和PBS组仍有血痂存在,创面炎症浸润较明显、炎症环境略有改善,有少量胶原纤维形成；正常BMMSCs组已接近痊愈,有粗大并明显走向的胶原纤维形成,糖尿病BMMSCs组尚有少量炎症细胞分布,规则积累的胶原蛋白较少。 6、创面愈合率 数码相机拍摄0d、7d、14d创面愈合情况,并用Image J软件测量其面积,计算出7d和14d创面愈合率。统计分析表明,7d时对照组、PBS组、糖尿病BMMSCs组、正常BMMSCs组愈合率分别为：54.46±6.27%、52.71±5.51%、67.06±6.94%、78.13±7.38%；14d时对照组、PBS组、糖尿病BMMSCs组、正常BMMSCs组愈合率分别为：61.21±6.16%、63.61±7.82%、90.31±2.37%、97.46±2.00%。采用One-Way ANOVA统计学方法进行分析,结果表明：对照组和PBS组之间无差异；BMMSCs移植组均好于对照组和PBS组,有统计学差异；正常BMMSCs组好于糖尿病BMMSCs组,两者之间有统计学差异。 结论 1、与对照组和PBS组相比,BMMSCs促进创面愈合效果明显； 2、各组创面免疫荧光检测VEGF的表达发现：BMMSCs移植组创面、EGF表达有所提高,提示BMMSCs促进创面愈合作用与创面组织血管新生增加有关； 3、与正常小鼠来源的BMMSCs相比,糖尿病小鼠来源BMMSCs体外活性有所下降,成脂成骨分化能力变差；且糖尿病小鼠来源BMMSCs促创面修复作用降低。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R641

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 裴瑛波;;骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年14期

2 田河林;韦立顺;许忠新;康艳辉;赵如同;金东岭;;糖尿病小鼠肾小球微血管密度与VEGF表达的研究[J];中国病理生理杂志;2012年02期

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本文编号：1215197