热损伤后大鼠表皮干细胞中HSP90的表达研究

发布时间：2017-12-04 19:33

  本文关键词：热损伤后大鼠表皮干细胞中HSP90的表达研究

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【摘要】：目的分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞(Epidermal stem cells,EpSCs),利用P2~P3代细胞建立热损伤模型,检测不同温度热损伤后细胞中HSP90的表达变化,探讨HSP90对热损伤后EpSCs转归模型的作用。方法剥离SD大鼠皮肤组织,采用“胰蛋白酶两步消化+Ⅳ型胶原差速贴壁10min”法分离和纯化大鼠EpSCs,用K-SFM培养基(keratinocyte serum-free medium)培养细胞。显微镜下观察细胞形态,通过克隆形成实验和生长曲线,计算细胞克隆形成率,绘制细胞生长曲线,以评价细胞的克隆形成能力和增殖能力。利用免疫荧光技术检测细胞表面标志物β1-integrin、K19和K10的表达情况,鉴定细胞表型并观察EpSCs的纯度。选择状态良好的2-3代EpSCs作为热损伤实验细胞,以37℃作为对照组,分别以41℃、43℃、45℃、48℃、51℃、53℃和55℃作为实验组的处理温度,在水浴锅中孵育10min。利用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)共染,测定热损伤后EpSCs的凋亡率和存活率;利用RT-PCR及Western Blot实验方法检测热损伤后EpSCs中HSP90基因转录及蛋白质表达情况。结果显微镜下观察所培养的细胞体积小、核质比大,细胞膜折光性强,细胞为不规则多角形,呈集落样生长,镜下可见典型的铺路石状结构。克隆形成实验和生长曲线表明,所培养的细胞在体外具有较强的克隆形成能力和增殖能力。细胞免疫荧光技术检测所培养的细胞表达干性标识β1-integrin和K19,不表达分化标识K10,显示了所培养的细胞纯度较高。Hoechst 33342和PI共染结果显示:与37℃对照组相比,在41℃~51℃之间,热损伤后EpSCs的凋亡率和死亡率随着温度的升高而递增,51℃达到细胞凋亡高峰,55℃细胞死亡率最高。RT-PCR及Western Blot实验检测结果一致显示:37℃对照组中HSP90表达量相对偏低;实验组细胞中HSP90表达变化明显,在41℃~48℃热刺激条件下,细胞中HSP90的表达量逐渐增加,其中45℃和48℃组中的表达量大致在同一水平;超过48℃后,HSP90表达水平逐渐下降。结论所培养的细胞符合Ep SCs生物学特征和表型,成功建立了SD大鼠表皮干细胞分离、纯化和培养方法;在一定温度范围内,热应激后的EpSCs中HSP90的基因转录及蛋白质表达水平上调,HSP90可能参与EpSCs的热应激反应并发挥细胞保护作用;48℃下热损伤细胞10min,为建立EpSCs热损伤转归模型的适宜条件,该模型可用于研究HSP90的细胞保护作用机制。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R644

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本文编号：1252133