hASCs及其CM对大鼠皮肤烧伤修复的作用及其机制研究

发布时间：2017-12-31 21:19

  本文关键词：hASCs及其CM对大鼠皮肤烧伤修复的作用及其机制研究　出处：《石河子大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 观察并比较人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells, hASCs）、脂肪干细胞条件培养基（human adipose-derived stem cells-conditioned medium,hASCs-CM）和大鼠成纤维细胞（dermal fibroblast, DF）对皮肤烧伤的修复作用，寻找脂肪干细胞修复皮肤作用中的关键分子和可能的干预因素。 方法： 1.利用胶原酶消化法对ASCs进行分离培养，绘制细胞生长曲线；应用流式细胞仪对P2、P3、P5的ASCs进行表面标志物检测；应用诱导分化培养基对ASCs向成脂、成软骨和成骨方向进行诱导分化，分化后分别行油红O、阿尔辛蓝和茜素红特殊染色鉴定；应用免疫荧光技术和PT-PCR技术对P1、P2、P5、P6细胞中Oct4和Sox2的表达情况进行分析。 2.收集获得正常、高碳酸和TGF-β1诱导三种培养条件下的hASCs-CM，检测hASCs-CM中分泌的多种生长因子VEGF、bFGF、 IGF-1和EGF。数据采用SPSS17.0统计软件进行方差分析。 3.胶原酶P消化法培养新生小鼠真皮层成纤维细胞，并进行传代、冻存和复苏。 4.选用200±20g的SD大鼠，建立III度烧伤模型。随机分为盐水对照组、MDF移植对照组、hASCs组、hASCs-CM组检测大鼠皮肤损伤修复情况。同时在7d、15d、21d和28d采集标本，并进行拍照。行HE染色观察大鼠烧伤皮肤组织的病理结构，通过图像分析软件比较创面愈合率。 5.用抗人线粒体抗体检测烧伤组织中人线粒体表达，进一步了解hASCs在损伤组织的分布情况。分别采集7d、15d、21d和损伤皮肤用免疫组化方法检测MMP1、MMP9、III、Ⅳ型胶原蛋白的表达情况，并用IPP6.0软件测OD值进行半定量分析，结果采用SPSS17.0软件进行方差分析。 结果： 1.原代及传代培养ASCs呈成纤维样贴壁生长，形态均一，细胞群体倍增时间为31h。各代ASCs均表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达CD34和CD45，也不表达CD8a、CD56和CD69；成脂、成软骨和成骨诱导后染色鉴定结果均为阳性；Oct4在P1、P2细胞中的表达位于细胞核内,而在P5、P6细胞的表达则位于胞质；Sox2在P1、P2细胞的胞质中表达，而在P5、P6细胞的胞质中几乎不表达。Oct4随着传代次数表达是逐渐减少的，Sox2在P1、P2细胞中可检测到RNA的表达，P5、P6细胞中无RNA表达。 2.与正常对照组比较，高碳酸环境组和TGF-β1组的ASCs-CM的VEGF、EGF、bFGF和IGF-1的含量明显增多，差异具有统计学意义（P 0.01）；TGF-β1组与高碳酸环境组的VEGF、bFGF和IGF-1相比，差异具有统计学意义（P 0.01），EGF组差异无统计学意义（P=0.086）。 3.新生小鼠背部皮肤经酶消化法后12-36h有贴壁细胞。细胞呈短梭形、多角形或不规则形。2～3d后细胞数量迅速增加成75%-90%汇合，传代细胞逐渐变为长梭形，胞质向外伸出伪足，细胞核呈卵圆形，居中。传代后细胞形态较为均一，排列规则，呈平行状、放射状、旋涡状生长。 4.统计烧伤创面的愈合率，结果表明细胞移植14d后，ASCs移植治疗组的愈合率为47.63%与ASCs-CM组(40.18%)、MDF组(37.85%)和盐水对照组（31.83%）相比具有统计学差异（P0.05）。在21d和28d与盐水组相比，，ASCs-CM组和DF组有一定的促进作用。ASCs移植组的皮肤愈合速度最快，肉芽组织成熟，胶原排列整齐，毛细血管较少，皮肤结构层次较清晰，且表面有毛长出。这提示ASCs在烧伤修复中有着很强的促进作用。 5.随着时间的推移，ASCs主要分布在创面。ASCs组在14d和21d III型胶原的表达量高于其他组，但7d时的表达量与其他组无统计学差异。ASCs组在14d和21d MMP1的表达量高于其他组，但7d时的表达量与其他组无统计学差异。不同时间点各组的Ⅳ型胶原表达量较少，差异无统计学意义。各组不表达MMP9。 结论： 1.通过对脂肪干细胞（ASCs）的原代及传代培养，研究了多能性分子Oct4和Sox2在ASCs中的表达，为ASCs的优化培养提供了线索和依据。 2.在高碳酸环境和TGF-β1诱导下，ASCs-CM中的生长因子含量均升高，而TGF-β1作用更明显，对ASCs-CM应用于临床提供了理论依据。 3. ASCs移植组的皮肤愈合速度最快，皮肤结构层次较清晰，且表面有毛长出。这提示ASCs在烧伤修复中有着很强的促进作用。 4. ASCs通过上调III型胶原和MMP1的表达，减少Ⅰ型胶原的合成和瘢痕形成，改善了Ⅰ/III型胶原的比例，促进烧伤的修复，为后续研究提供了思路和线索。 5.在烧伤修复的早中期，各组表达少量的Ⅳ型胶原，不表达MMP9。由于Ⅳ型胶原在表皮功能的重塑和瘢痕形成中有着重要的作用。后续研究中可延长时间观察其变化，进一步了解其在烧伤修复中的作用。
[Abstract]:Objective:
To observe and compare the human adipose derived stem cells (human adipose-derived stem cells, hASCs), medium adipose derived stem cells (human adipose-derived stem Cells-conditioned medium conditions, hASCs-CM) and rat fibroblasts (dermal fibroblast, DF) on the skin burn repair effect, find the key molecules of adipose derived stem cells to repair the skin effect and the possible the intervention factors.
Method锛

本文编号：1361518