气体信号分子硫化氢对脑外伤的神经保护作用及其机制研究

发布时间：2018-01-31 12:15

  本文关键词： 脑外伤 硫化氢 神经保护 凋亡 自噬　出处：《苏州大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：脑外伤（Traumatic brain injury, TBI）是造成青年人神经系统功能障碍的最常见原因，脑外伤后继发性脑损伤是造成神经元死亡和神经功能障碍的主要原因。保护神经元成为临床治疗脑外伤的重要措施。硫化氢（Hyrogen sulfide, H2S）是继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第三种具有生物活性的内源性气体信号分子，在中枢神经系统生理状态及各种病理改变中发挥着重要作用。本研究中，我们将探索H2S对小鼠脑外伤后神经功能是否具有保护作用，并探索H2S与神经细胞死亡（凋亡和自噬）之间的关系。 方法： 利用改良的自由落体装置建立小鼠TBI模型。利用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学、免疫荧光等技术观察在内源性硫化氢合成酶胱硫醚-β-合成酶在小鼠脑外伤后脑组织不同时间（1h，6h，12h，1d，2d，3d，7d）的表达变化、神经细胞定位以及使用亚甲基兰法检测血浆及脑组织中内源性硫化氢浓度。为了探讨外源性硫化氢对脑外伤后神经功能是否有保护功能，脑损伤前后不同时间点（损伤前30min、损伤后15min，30min，1h，2h，4h）给予不同浓度（0.1-45μmol/kg）硫化氢供体NaHS检测脑组织的含水量变化。用组织缺损体积（lesion volume，LV）评估脑外伤后脑组织缺损情况，应用行为学试验（运动功能和Morris水迷宫试验）评估脑外伤后神经功能。为了进一步探索NaHS对脑外伤后神经保护机制，，采用脑外伤前30min腹腔注射给予NaHS，采用体视学显微镜观察小鼠大脑损伤皮质及周边区，海马CA1，CA3及DG区PI阳性细胞数，研究NaHS预处理对TBI引起的早期神经细胞质膜完整性破坏的影响以及检测损伤后损伤皮质区及海马区凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白表达水平，并对凋亡和自噬激活进行探讨。 结果： （1）小鼠脑外伤内源性硫化氢浓度在血清、脑皮质及海马组织中变化趋势一致，呈先降低后升高。免疫荧光双标结果证实内源性硫化氢合成酶胱硫醚-β-合酶（cystathionine-beta-synthase，CBS）在脑组织中广泛表达。CBS与神经元标记物TUJ1共定位，而与星形胶质细胞标记物（GFAP）、小胶质细胞标记物（CD11b），少突胶质细胞标记物（Cnpase）没有共定位。脑外伤后大脑皮质和海马组织CBSmRNA和蛋白表达结果表明随着TBI时程的延长CBS表达逐渐降低，分别在TBI后3d和2d降到低谷后开始表达上调，呈先下降后上升的趋势。脑外伤后CBS酶活性也呈先下降后上升的趋势。 （2）与sham组比较，TBI后损伤侧脑组织含水量呈先增加后降低的趋势，损伤后6h含水量增加，1d达到高峰，之后略有下降，差异具有统计学意义。给予不同剂量外源性硫化氢供体NaHS，损伤前30min给1μmol/kg NaHS改善脑水肿较明显。与TBI组相比，NaHS预给药组能明显改善脑外伤后脑缺损体积和皮质体积缺损、减少海马CA1区的神经元的受损情况、加快小鼠运动功能和学习记忆功能恢复。 （3）与TBI组对比，NaHS预处理（1μmol/kg）能明显减少TBI后6h损伤皮质区及海马区（CA1，CA3和DG）PI阳性细胞。此外，在正常组，假手术组及损伤对侧半球的皮质区及海马区均没有发现PI阳性细胞。免疫印迹分析显示NaHS能下调损伤皮质区及海马的Caspase-3的激活并上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。同时，NaHS能抑制TBI诱导的自噬的激活，即抑制LC3II，Beclin-1及Vps34等蛋白的激活，上调P62的蛋白水平。 结论： （1）脑外伤后脑组织内源性硫化氢浓度及其合成酶CBS表达和酶活性随着损伤时间延长呈先下降后上升的趋势，提示脑外伤抑制内源性硫化氢的生成； （2）外源性硫化氢能减轻脑外伤后脑水肿，脑缺损体积以及改善脑神经功能，可能对脑外伤后神经功能有保护作用； （3）硫化氢能通过抑制脑外伤后早期质膜的破坏进而减少神经细胞死亡（凋亡和自噬）的激活实现其神经保护机制。
[Abstract]:Objective: traumatic brain injury (Traumatic brain, injury, TBI) is the most common cause of young people nervous system dysfunction, brain secondary brain injury after trauma is a major cause of neuronal death and neurological dysfunction. Protection of neurons become important measure of the clinical treatment of traumatic brain injury. Hydrogen sulfide (Hyrogen sulfide H2S) is the discovery of third after nitric oxide and carbon monoxide gasotransmitter with biological activity, plays an important role in the state and various kinds of pathological changes in the central nervous system physiology. In this study, we will explore the H2S of mouse nerve function after traumatic brain injury and explore the protective effect of H2S, and neuronal cell death (apoptosis and autophagy). The relationship.
Method锛

本文编号：1479042