烟碱型乙酰胆碱受体异质化在脓毒症致骨骼肌对非去极化肌松剂敏感性下降中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-03 07:00

本文关键词： 脓毒症非去极化肌松剂烟碱型乙酰胆碱受体药理学电生理蛋白酶抑制剂　出处：《重庆医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的研究不同病程阶段的脓毒症对非去极化肌松剂（Non-depolarizing neuromuscular block agents，NMBA）量效及时效的影响；从神经肌接头（Neuromuscular junction，NMJ）突触后膜烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）的异质化探讨脓毒症导致NMBA药理学变化的发生机制；验证乌司他丁改善NMBA药效作用的有效性以及对NMJ突触后nAChR异质化的作用。方法第一部分选择健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠66只，鼠龄2~3月，体重200~220g，随机分为正常组（Normal组，n=6）、假手术组（Sham组，n=6）以及脓毒症组（Sepsis组）。Normal组大鼠不予任何处理。Sham组大鼠仅行开腹盲肠探查，不予盲肠结扎。Sepsis组大鼠通过盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture，CLP）构建脓毒症模型。在建模（Sepsis组）或手术（Sham组）后第1天（Day1组，n=6）、第3天（Day3组，n=6）、第7天（Day7组：Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）以及第14天（Day14组：Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）进行指标检测和标本采集。按剂量累计法给予非去极化肌松剂维库溴铵（初始剂量为0.05mg/kg，以0.05mg/kg为递增剂量，最大剂量达到1mg/kg）。以0.1Hz频率刺激坐骨神经，检测单次肌颤搐收缩力，计算维库溴铵的最大单次肌颤搐抑制百分率（%），以相应药物剂量拟合量效曲线。通过软件得到维库溴铵的半数有效抑制浓度（IC50）和95%有效抑制浓度（IC95）。最后单次给予2×IC95的维库溴铵，记录药物起效时间、维持时间以及恢复时间。第二部分选择健康成年雄性SD大鼠60只，鼠龄2~3月，体重200~220g，随机分为Sham组以及Sepsis组。Sepsis组大鼠通过CLP构建脓毒症模型。Sham组大鼠仅行开腹盲肠探查术，不予盲肠结扎。各组分别在建模后1天（Day1组，n=6）、3天（Day3组，n=6）、7天（Day7组，Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）以及14天（Day7组，Sham组中n=6，Sepsis组中n=12）进行指标检测和标本采集。各组大鼠分别在建模或手术前、后检测胫前肌复合肌动作电位（Compound muscle actionpotential，CMAP），测定其波幅和时程，计算运动神经传导速度（Motornerve conduction velocity，MCV），同时测定单次肌颤搐收缩力。取大鼠胫前肌组织，运用免疫组化和免疫荧光法测定γ-nAChR和7-nAChR在骨骼肌细胞膜上的表达和分布；通过western-blot测定这两种蛋白表达量；采用RT-PCR法测定γ和7功能亚基mRNA的表达水平；取L4~L5节段脊髓前角神经组织，通过western-blot测定neuregulin-1蛋白表达量。第三部分选择健康成年雄性SD大鼠24只，鼠龄2~3月，体重200~220g，随机分为生理盐水对照组（0.9%N.S组，n=12）和乌司他丁组（Ulinastatin组，n=12）。各组大鼠通过CLP构建脓毒症模型，在建模后第10天静脉给予乌司他丁5000u/kg（Ulinastatin组）或给予等容量0.9%N.S（0.9%N.S组），每天1次，连续3天。各组大鼠在建模后第14天进行指标检测和标本采集。维库溴铵药效学研究方法同实验第一部分。神经电生理检测和蛋白检测检测同实验第二部分。结果第一部分（1） Sham组各亚组维库溴铵IC50与Normal组比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵IC50与Normal组和Sham组比较，差异无统计学意义（P0.05）,其余各组与Normal组和Sham组比较，差异均有统计学意义（P0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异均无统计学意义（P0.05）。Sepsis组各亚组之间比较，差异均有统计学意义（P0.05）；Sepsis组和Sham组在建模/手术后同一时间的亚组比较，除Day1组差异无统计学意义（P0.05），其余各组比较差异均有统计学意义（P0.05）。（2） Normal组与Sham组各亚组的起效时间比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵起效时间与Normal组比较，差异无统计学意义（P0.05），其余各组与Normal组比较，差异均有统计学差异（P0.05）。在建模后同一时间组比较，Sepsis组的Day1组和Sham组的Day1组差异无统计学意义（P0.05），其余时间组比较，差异均有统计学差异（P0.05）。 Normal组与Sham组各亚组的维持时间比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵维持时间与Normal组比较，差异无统计学意义（P0.05），其余各组与Normal组比较，差异均有统计学差异（P0.05）。在建模后同一时间组比较，Sepsis组和Sham组的维持时间在Day1差异无统计学意义（P0.05），其余时间组比较，差异均有统计学差异（P0.05）。 Normal组与Sham组各亚组的恢复时间比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sham组各亚组之间比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组中，Day1组维库溴铵恢复时间与Normal组比较，差异无统计学意义（P0.05），其余各组与Normal组比较，差异均有统计学差异（P0.05）。在建模后同一时间组比较，Sepsis组和Sham组的恢复时间在Day1差异无统计学意义（P0.05），其余时间组比较，差异均有统计学差异（P0.05）。第二部分（1） Sham组各亚组的CMAP幅值比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组各亚组的CMAP幅值比较，差异有统计学意义（P0.05）。Day1组幅值最高，Day14组CMAP幅值最低。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P0.05）。 Sham组各亚组的CMAP时程比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组各亚组的CMAP时程比较，差异有统计学意义（P0.05）。Day14组时程最长，Day1组CMAP时程最短。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P0.05）。 Sham组各亚组的MCV比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组各亚组的CMAP幅值比较，差异有统计学意义（P0.05）。Day1组MCV最高，Day14组MCV最低。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P0.05）。（2）Sham组各亚组的肌颤搐收缩力比较，差异无统计学意义（P0.05）。Sepsis组各亚组的肌颤搐收缩力比较，，差异有统计学意义（P0.05）。Day1组肌颤搐收缩力最高，Day14组肌颤搐收缩力最低。Sepsis组和Sham组在建模后同一时间组比较，差异有统计学意义（P0.05）。（3）与Sham组比较，脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14组的大鼠骨骼肌γ-nAChR蛋白表达逐渐增高；在脓毒症建模后14天，γ-nAChR蛋白表达最高，差异有统计学意义（P0.05）。γ-nAChR蛋白分布于骨骼肌细胞膜上。γ-nAChR功能亚基γ亚基mRNA表达的变化趋势与蛋白表达变化趋势一致。与Sham组比较，脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14的大鼠骨骼肌7-nAChR蛋白表达逐渐增高；在脓毒症建模后14天，7-nAChR蛋白表达最高，差异有统计学意义（P0.05）。7-nAChR功能亚基7亚基mRNA表达的变化趋势与蛋白表达变化趋势一致。（4）与Sham组比较，Sepsis组各组的大鼠骨骼肌终板膜增高；脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14组的大鼠骨骼肌终板膜比较，差异有统计学意义（P0.05）。随着脓毒症模型建模时间越长，终板膜的面积逐渐增加。（5）与Sham组比较，脓毒症Day1、Day3、Day7以及Day14组的大鼠脊髓背角神经元的neuregulin-1蛋白表达降低；在脓毒症建模后14天，neuregulin-1蛋白表达达到最低，差异有统计学意义（P0.05）。随着脓毒症模型建模时间越长，neuregulin-1蛋白表达逐渐降低。第三部分（1）Ulinastatin组大鼠胫前肌CMAP的幅值和神经传导速度与0.9%N.S组大鼠比较，差异有统计学意义（P0.05），而时程比较，两组差异无统计学意义（P0.05）。（2） Ulinastatin组大鼠胫前肌单次肌颤搐收缩力高于0.9%N.S组大鼠，差异有统计学意义（P0.05）。（3）与0.9%N.S组比较，Ulinastatin组大鼠胫前肌γ-nAChR蛋白表达降低，差异有统计学意义（P0.05）。同样，Ulinastatin组大鼠胫前肌γ-nAChR功能亚基γ mRNA表达水平低于0.9%N.S组（P0.05）。与0.9%N.S组比较，Ulinastatin组大鼠胫前肌7-nAChR蛋白表达降低，差异有统计学意义（P0.05）。Ulinastatin组大鼠胫前肌7-nAChR功能亚基7mRNA表达水平低于0.9%N.S组（P0.05）。（4）与0.9%N.S组比较，Ulinastatin组大鼠脊髓背角神经元neuregulin-1蛋白表达增高，差异有统计学意义（P0.05）。结论（1）脓毒症导致骨骼肌对非去极化肌松剂敏感性下降，表现为肌松作用下降，肌松起效时间延长，维持时间和恢复时间缩短。同时，脓毒症导致神经肌肉功能障碍，骨骼肌收缩力下降，复合肌动作电位幅值降低，神经传导速度减慢，发生脱髓鞘改变；（2）脓毒症导致骨骼肌细胞膜上胎儿型乙酰胆碱受体γ-nAChR和神经型乙酰胆碱受体7-nAChR表达升高，并分布于骨骼肌整个细胞膜。脓毒症的非去极化肌松剂的肌松作用下降与这两种非成熟型nAChR受体的表达有关；（3）蛋白酶抑制剂乌司他丁可抑制脓毒症导致的骨骼肌细胞膜上γ-nAChR和7-nAChR的表达上调，促进神经肌肉功能的恢复，改善骨骼肌对非去极化肌松剂的敏感性
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7

【参考文献】